GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

サマリー

本プロトコルでは、一意に切断可能なGST-タグおよび小Hisタグを組み合わせることにより組換えタンパク質の精製を可能にする非常に効率的で費用対効果の高い小規模タンパク質精製方法を実証する。

要約

インビトロにおけるタンパク質の生化学的特徴付けのための酵素学における重要なアッセイは、関心対象の精製されたタンパク質の高濃度を必要とする。タンパク質精製プロトコルは、効率性、単純性、および費用対効果^1を結合する必要^があります。ここでは、N-末端グルタチオンセファロースタグ^（GST）2,3両融合されるC-末端10xHisタグ⁴に基づいて、組換えタンパク質のための新たな小規模アフィニティー精製システムとしてGST-Hisの方法を記載目的のタンパク質に。後者の構築物は、タンパク質発現のために⁵感染したSf9細胞の感染のために、バキュロウイルスを生成するために使用される。 GSTは、浄化効率を確保するのに役立つかなり長いタグ（29 kDa）のである。しかしながら、タンパク質の生理学的特性に影響を与えるかもしれない。従って、それは、その後、プレシジョン酵素^6を用いてタンパク質から切断される。最大の純度を保証し、切断されたGSTを除去するために、我々比較的小さいHisタグに基づいて、第二のアフィニティー精製工程を追加した。重要なことには、我々の技術が劣化したタンパク質を除去し、従って、完全長タンパク質を豊かにするための効率的なツールであるタンパク質の両端に隣接する2つの異なるタグに基づいている。ここで紹介する方法は、FPLC等の高価な楽器のセットアップを必要としない。さらに、我々は、夾雑核酸廃止する熱ショックタンパク質不純物およびヌクレアーゼ処理を除去するためにMgCl ₂およびATPの洗浄を組み込んだ。要約すると、隣接する2つの異なるタグの組合せN-およびC-末端とタグのいずれかを切断する能力が、興味のある高度に精製された全長タンパク質の回収で評価する。

概要

組換えタンパク質の精製は、生化学の基本的な質問に対処することが重要である。イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ​​排除クロマトグラフィーのようなタンパク質精製の従来の方法は、それぞれ、例えば、その等電点、電荷またはサイズなどの標的タンパク質の物理的性質に依存する。後者のタンパク質特性が大幅に従来のタンパク質精製方法でタンパク質を汚染する可能性を増大させる種々のタンパク質が共有されています。この問題は、時間がかかり、複数の精製カラムの使用により回避することができる。同時に、後者のクロマトグラフィー法は、高価な実験装置を要求する。ほとんどの場合、タグは、目的のタンパク質に固有であるように、アフィニティータグ精製が強く、標的特異性を増加させる。最近の研究では、違反またはHA-アフィニティー精製が広く用いられている。

既存rec視聴とは対照的に単一のタグが使用されるombinantタンパク質精製プロトコルは、2つのタグのユニークな組み合わせを確立した。我々の方法は、所望のタンパク質の量と純度との間の最適な比率のために、目的のタンパク質のC末端にN-末端およびHisタグにおけるGST-タグの融合を含む。 GSTはグルタチオンセファロースビーズでの精製のための非常に効率的で、長いタグ（29 kDa）の、ある。さらに、GSTを使用すると、本手法¹の費用対効果を保証します。 （わずか2つのアミノ酸の付加、その結果、認識配列LeuGluValLeuPheGln / G....

プロトコル

1。組換えバキュロウイルスの作製

バキュロウイルスは、主に、わずかな修正を加えた製造業者のプロトコルに従って、Invitrogen社のBac-to-Bacバキュロウイルス発現系を用いて生成されます。

1. 修正するpFastBac1ベクター（Gibco社、生命）は、GSTおよびHis-タグ（ 図2）を含む作成されました。をpET-52bの（+）ベクター（Novagen）のマルチクローニングサイト（MCS）は、10xHisタグを含有するpFastBac1-ストレプト-10xHisを生成するようにするpFastBac1ベクターのMCSに挿入した。をpET-52bの（+）MCS配列が5 '端および3にHindIII制限部位'端におけるBglII制限部位を付加する、XbaIおよびBlpIを制限部位の間に増幅されたPCRであった。 PCR産物は、次いで、BamHIおよびBglII制限配列の相溶性を使用して、pFastBac1のBamHIおよびHindIIIの制限部位間にクローニングした。目的は、の発現を可能にするpFastBac1を生成することであったのでストレプトアビジンと10xHisタグを用いる組換えタンパク質、ペット-52B（+）のBamHI制限部位がMCSの配列が使用されませんでした。また、XbaI制限部位が既にするpFastBac1のMCSとをpET-52bのMCSに挿入し、これらの（+）内のサイト間で生じる制限....

結果

GST-Hisの精製プロトコールの効率を例証するために、我々はRec14、S.精製 32.9 kDaでpombeのタンパク質。 Rec14 cDNAは、N-およびC-末端GST-およびHis-タグの付加を可能にする我々の修飾するpFastBac1ベクターであった（ 図1A）にクローニングした。組換えバキュロウイルスを調製し、次いで、タンパク質発現のためにSF9に感染した細胞に感染させた。可溶性細胞溶解物をGSTビーズと共にインキュベートし、結合したタンパク質を、PreScissionプロテアーゼとGSTを切断することにより溶出した。得られたRec14は-Hisタンパク質はアフィニティーTALON樹脂上で精製し、結合したタンパク質を500mMのイミダゾールを含むTALON緩衝液で溶出したであった。精製されたRec14-Hisを、記憶バッファに透析し、-80℃（ 図1B）で保存した。

Rec14組換えバキュロウイルス、または対照として偽感染に感染したSF9細胞からの可溶性および全.......

ディスカッション

ここで紹介する、GST-Hisの精製プロトコルは、組換えタンパク質の大きさの広い範囲の精製に適している：我々は成功して李 RAD51（41kDa）、piBRCA2（120kDa）、PALB2（130kDa）、および不安定な高分子量のタンパク質の精製リーシュマニア幼児 ： 李 ^{BRCA2（125kDa）6,9。}また、このプロトコルを使用して精製したタンパク質は^、6生化学的に活性であった。この方法の成功は、単に所望のタンパク質の発現、溶解度および安定性に依存する。

例えば大腸菌のような他のホストでの発現のための分子生物学的ベクトル、 大腸菌や酵母は、簡単に、広く利用可能な、GSTやHisタグを使用して変更できます。これは、ほとんどの分子生物学の実験室のための本技術の適用可能性と費用対効果を強調しています。様々な利点がrecombinan細菌または哺乳動物細胞上で、感染した細胞を選択する我々の決定に影響を与えたトンタンパク質の発現および精製。例えば、このよ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
REAGENTS
>E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Sf9 感染細胞	ATCC	CRL-1711
PreScission enzyme	GE Healthcare	27084301
Grace's infected medium supplemented	Gibco (Life)	11605-094
Fetal Bovine Serum Characterized	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)	Gibco(生命)	15070-063
グルタチオンセファロース樹脂	GEバイオサイエンス	17075605
プロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	11873580001
タロン樹脂	クロンテック	635504
イミダゾール	バイオショップ	288324
ゲンタマイシン	ギブコ(生命)	15710064
ポリクローナルGST抗体	自社
モノクローナル6X-His抗体	Clontech	631212
EQUIPMENT
Dounce ホモジナイザー (タイト)	ウィートン	357546
ソニケーター (フィッシャー ディスメンブレーター)	フィッシャー	モデル 150
透析バッグ (50 mm)	フィッシャー サイエンティフィック

生産2115217