体内 神经元钙成像在 C. elegans 中的应用

摘要

凭借其微小透明的身体、详尽记录的神经解剖结构，以及一系列适用的遗传学技术和试剂， 秀丽隐杆线虫 是理想的模式生物 体内 使用相对简单且低成本的技术进行神经元成像。本文描述了利用基因编码的荧光钙指示剂在完整成年动物体内进行单个神经元成像的方法。

摘要

线虫 秀丽隐杆线虫 是进行相对简单且低成本神经成像的理想模式生物 体内其微小透明的身体和结构简单且特征明确的神经系统，使得可在完整动物体内识别并进行任意神经元的荧光成像。通过简单的固定技术，可对动物生理状态产生最小干扰，从而实现长时间的延时成像。基因编码的钙离子敏感型荧光探针（如cameleon）的发展 ¹ 和 GCaMP ² 允许 在体 神经元钙成像，关联细胞生理学与神经元活动。大量表达这些荧光蛋白的转基因品系可直接获得，或可通过成熟技术构建。本文详细描述在单个神经元内测量钙动态变化的实验步骤 体内 同时使用GCaMP和cameleon。我们讨论了这两种方法的优缺点，以及各种样品制备（动物固定）和图像分析方法。最后，我们展示了两个实验的结果：1）利用GCaMP测量特定神经元对外部电场的感官反应；2）利用cameleon测量神经元对激光创伤的生理性钙反应。此类钙成像技术在 秀丽隐杆线虫 并已扩展应用于自由活动动物的测量、多个神经元的同步记录，以及不同遗传背景之间的比较。 秀丽隐杆线虫 呈现了一个稳健且灵活的系统 体内 在技术简便性和成本方面，神经元成像相较于其他模型系统具有优势。

引言

本文介绍了实用的方法 体内 钙成像在 秀丽隐杆线虫 神经元。具有高信噪比的基因编码钙敏感荧光探针的发展使得 秀丽隐杆线虫 一种相对简便且成本效益较高的神经系统生理活动测量系统。我们的成像采用标准的复式显微镜，结合广泛可用的荧光染料进行宽场荧光成像。本文介绍了多种使用不同荧光染料及样品制备方法的技术，并讨论了每种方法的优势与局限性。随后展示了两个示例实验的数据结果。关于此处所述技术的另一优秀参考资料可参见WormBook中的文章《Imaging the activity of neurons and muscles》（作者：R. Kerr）。http://www.wormbook.org) ³.

在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，常用的基因编码荧光钙离子探针主要有两大类：单通道GCaMP和基于FRET的钙调蛋白探针（cameleon）。我们将介绍每种方法的具体操作，并展示相应的数据示例。

GCaMP 是基于一种对周围钙离子浓度敏感的改良型绿色荧光蛋白（GFP）构建而成。其原理是将 GFP 与高钙亲和力蛋白钙调蛋白（calmodulin）融合，使得钙调蛋白结合钙离子后，促使 GFP 分子构象转变为高效荧光状态

方案

1. 光学装置

1. 使用具有落射荧光成像功能的标准复式显微镜。我们采用尼康Eclipse Ti-U倒置显微镜，配备Intensilight HG照明器。
2. 为获得最佳的图像和信号质量，应使用高放大倍数、高数值孔径的物镜。我们通常使用尼康X60 1.4 N.A.油浸物镜。在某些情况下，可根据荧光探针的表达水平和信号强度，使用较低放大倍数（X40、X20）的物镜。
3. 使用高灵敏度冷却CCD相机（如Andor Clara相机）以最大程度提高图像灵敏度并降低背景噪声。
4. 对于单色荧光染料，使用专为该荧光染料特定波长设计的标准显微镜荧光滤光片组。对于GCaMP，使用标准的GFP滤光片组，其激发波长优化为488 nm，发射波长优化为525 nm。无需进一步的光学改装。
5. 对于比例荧光探针（如cameleon），应使用双通道成像系统，以便在两个不同波长下同时获取相同图像。该目标可通过将双图像并排投射到相机上实现。图中展示了一种利用光学级面包板上的基本光学元件构建此系统的简易装置。 图1包括：
   1. 配备440 ±20 nm激发滤光片和455 nm长通二向色镜的显微镜滤光片组
   2. 在显微镜成像端口外侧的初始像平面位置（通常为相机CCD传感器所在位置）放置一个图像掩模，该掩模可限制视场范围，使其仅占据相机传感....

结果

本文展示了两个独立实验的结果。第一个实验采用GCaMP来测量特定感觉神经元对明确定义的外部刺激的反应，很好地示例了如何利用荧光钙指示剂在完整秀丽隐杆线虫（C. elegans）中光学监测神经元活动。第二个实验则采用cameleon来测量特定激光损伤后神经元内触发的细胞内钙瞬变，从而说明如何在活体（in vivo）条件下对单个细胞的钙生理学进行测量。为了聚焦于每种测量方法的技术细节，本文详细呈现并讨论了单次实验的结果。通常，研究人员会计算随时间变化的平均反应（即在每个时间点相对于刺激的反应平均值），或计算特定指标（如反应的平均振幅），这些指标均基于多次实验的结果。通常需要进行10至20次实验才能获得可接受的平均测量值，但具体次数取决于反应本身的固有变异性。本文所讨论实验的相关数据分析可参见文献¹²和¹³。

GCaMP测量感觉反应： 当施加较强的外部电场（≥3 V/cm）时，秀丽隐杆线虫 主动向电场的负极精确爬行。我们先前的研究表明，这种趋电性行为主要由动.......

讨论

基因编码的钙离子指示剂已广泛应用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）神经生物学研究中。多个研究团队已采用这些技术来研究初级感觉神经元对外部刺激的反应，本文中展示的ASJ神经元对电场的响应即为一例。典型的研究包括对机械触觉、特定化学物质、温度以及电场的感知^{12, 16-19}。中间神经元和肌肉细胞的活动也已被监测，无论是在刺激下的响应，还是在调控动物行为过程中的作用。许多此类研究进一步结合图像识别与追踪技术，使研究人员能够在部分固定甚至自由活动的动物体内记录神经元活动，并实现多个神经元的同步记录。此外，还有一些研究探讨了钙离子生理学的其他方面，例如神经元损伤后的钙信号响应^{13, 20}（本文亦有展示），以及在较长时间尺度上的神经元退行性变化²¹。

在设计特定实验时，应仔细考虑常用钙离子探针和动物固定方法的各种替代技术。固定方法的选择取决于技术因素，例如是否需要对动物进行物理操作、成像后是否需要恢复动物，或是否需要高通量处理。不同的荧光钙离子探针也各有其优缺点。GCaMP 采用简单的单通道图像分析，且具.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Eclipse Ti-U 倒置显微镜 显微镜	尼康
Intensilight HG 照明器	尼康	C-HGFI	荧光光源
CFI Plan Apo VC 60X 油镜	尼康
光学平台或 3'X3' 光学平台 面包板等级	Thor Labs		如果不使用光学平台，一个 光学级面包板上的 坚固的实验台应 足够。
Clara Interline 相机	Andor 技术		高灵敏度CCD相机
wtGFP 长通发射	Chroma Technology 公司	41015	用于成像 GCaMP 的 GFP 滤光片组
440 ± 10 nm 滤光片	Chroma	D440/20x EX	cameleon激发滤光片
二向色镜 &> 455 nm 长通滤光片	Chroma	455DCLP BS	用于cameleon的显微镜二向色镜 成像
二向色镜 &> 515 nm 长通滤光片	Chroma	515DCLP BS	用于cameleon的二向色镜 成像
535 ± 15 nm 滤光片	Chroma	D535/30m EM	YFP发射滤光片
滤光片 480 ± 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP发射滤光片
镜头，200 mm，消色差	Thor Labs	AC508-200-A1	FRET 光学中继透镜（3）
银宽带镜	Thor Labs	ME2S-P01	FRET 光学系统（2）
NGM 缓冲液
左旋咪唑	Sigma
聚苯乙烯微球	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by 体积，50 nm 直径	聚苯乙烯纳米颗粒用于 C. 秀丽隐杆线虫 固定
转基因品系，品系 gpa-9::GCaMP3（在 pha-1 背景中） him-5 bkg	Sternberg 实验室	品系 PS6388
转基因品系， mec- 4::YC3.60	加贝尔实验室	品系 CG1B