Достижение понимания систем уровня клеточных процессов является целью современной клеточной биологии. Мы описываем здесь стратегий для мультиплексирования люциферазе журналистам различных клеточных функций конечными точками, чтобы допросить использованием функции гена генома РНК-интерференции масштабе библиотек.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мультиплексированную Люциферазы скрининга на основе Платформы Допрос связанных с раком передачи сигнала в культуре клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Геном масштаба допроса функции гена использованием РНК-интерференции (РНК-интерференции) обещают стать для быстрой идентификации химически послушный уязвимостей раковой клетки. Ограничение потенциал этой технологии является невозможность быстро очертить механистической основе фенотипических результаты и таким образом учтены при разработке молекулярно целевых терапевтических стратегий. Мы выделяем здесь методы деконструировать сотовой фенотипа индуцированных РНК-интерференции-опосредованного генного таргетинга использованием мультиплексированных репортер системы, которые позволяют мониторинг основных раковых клеток-связанные с ним процессы. Это высокое содержание методологии скрининга является универсальным и может быть легко адаптирована для скрининга других типов больших молекулярных библиотек.
Введение
Разнообразие люциферазы на основе репортеров для мониторинга разнообразных клеточных биологических процессов являются коммерчески доступными. Большинство из этих конструкций ДНК, кодирующих люциферазы белки, которые индуцируют экспрессию на специфические стимулы клетки или возмущений. Самые надежные транскрипционно основе репортеров поместить выражение фермента люциферазы под контролем синтетического элементов или энхансер промотора гена областей хорошо установленных для их надежности в сообщении об физиологически значимых транскрипционный 1,2 события. Есть также транс-репортер люциферазы системы, которые используют GAL4-UAS ездить экспрессию люциферазы бе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Весь протокол занимает около 4 дней.
1. Подготовка клеток для трансфекции миРНК и Репортер
Мы представим здесь протокол допроса миРНК библиотеки, используя небольшой набор киРНК (384 бассейнов различных миРНК массиве в 96 формате с каждым бассейном, состоящий из 4х киРНК На одного гена) из генома миРНК библиотекой в иллюстративных целях. Для данного конкретного исследования, мы будем использовать НСТ116, которые демонстрируют девиантное Wnt и Крас сигнализацией, а активность р53. Соответствующую клеточную линию в исследований, направленных на допроса других клеточных процессов интерес должны быть определены и ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Несмотря на успехи в отображении мутационные пейзаж различных видов рака используя огромное секвенирование генома усилий 12-14, мы все еще не иметь в наличии системного подхода к переводу этих наблюдений в стратегии вмешательства. В колоректальный рак (CRC), мутации, которые, по прогнозам, влияют три компоненты клеточных процессов - Wnt / β-катенина, p53 и Крас сигнализация - встречаются в 99% всех опухолей предполагая, что они являются ключевыми факторами трансформации клеток в кишечнике 13. Так.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть несколько поставщиков люциферазы системы на основе репортера (например, Promega, целеуказания, New England Biolabs и Thermo Fisher), которые обеспечивают полезные он-лайн ресурсы для тех, развлекательные высокой пропускной экране в первый раз. Кроме того, множество отличных отзывов относительно оптимизации использования высокой пропускной экраны для обнаружения генов и как РНК-интерференции на основе результатов обследования может быть интегрирована с другими-омик основе наборов данных должны быть полезны 15,1.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
ОК и LL являются авторами на запатентованную касающиеся мультиплексированными люциферазе технологии.
Благодарности
Мы признаем финансовой поддержке CPRIT (RP100119) и Фонд Уэлч (I-1665).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | ||
| Система профилирования люциферазы 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | ||
| Реагент для трансфекции эффектена | Qiagen Inc. | ||
| Двухлюциферазная репортерная система | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Реагент | Таргетные системы | VLAR-1 | |
| HCT116 клетки | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Цитотоксичность | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Микропланшетный диспенсер | Labsystems Inc. | Модель 832 | |
| Автоматизированная лабораторная станция Biomek FXP | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-многорежимный микропланшетный считыватель HTS | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Гемацитометры Райхерта | Hausser Scientific Company | 1490 |
Ссылки
- Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
- Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent repor....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Мультиплексный люциферазный скринингпередача сигналов в раковых клеткахгенный таргетинг с помощью РНК-интерференциирепортерные генные анализыанализ активности люциферазы светлякаизмерение секретируемой люциферазыподготовка клеточного лизатапротокол транзиентной трансфекцииклетки колоректального рака HCT116мониторинг активности сигнальных путей
