Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Zusammenfassung

Mit dem Wunsch, die Beiträge von mehreren Zellelemente auf die Entwicklung eines komplexen Gewebe zu verstehen, wie die zahlreichen Zelltypen, die bei der Regeneration von Gewebe, Tumorbildung oder Vaskulogenese zu beteiligen, entwickelten wir ein mehrfarbiges Zelltransplantationsmodell der Tumorentwicklung in welche Zellpopulationen stammen aus verschiedenen fluoreszierend gefärbten Reportergen-Mäusen transplantiert und, gepfropft oder in und um einen Tumor zu entwickeln injiziert. Diese farbigen Zellen werden dann rekrutiert und in den Tumor Stroma eingearbeitet. Um die quantitative Erfassung Knochenmark Tumor Stroma-Zellen transplantiert wir GFP-exprimierenden transgenen ganze Knochenmark in letal bestrahlten Mäusen RFP exprimieren wie IACUC genehmigt. 0ovarian Tumoren, die orthotop in die transplantierten Mäusen injiziert wurden, wurden 6-8 Wochen nach der Transplantation entnommen und für die Knochenmark-Marker der Herkunft (GFP) sowie Antikörper-Markierungen, um Tumor-assoziierte erkennen analysiertStroma mit multispektrale Imaging-Techniken. Wir haben dann eine Methodik angepasst nennen wir MIMicc-Multispektrale Abfrage der Multiplex-Zellmassen mit multispektralen Entmischung fluoroprobes quantitativ zu beurteilen, welche Zelle kam, von dem ausgehend Populationen (basierend auf Original-Reportergens Etiketten), und unsere Fähigkeit, entmischen 4, 5 beschriftet , 6 oder mehr Spektren pro Folie steigt, haben wir zusätzliche Immunhistochemie mit Zelllinien oder Differenzierung, um eine höhere Präzision assoziiert aufgenommen. Den Einsatz von Software zu co-lokalisiert Multiplex-Fluoreszenzsignale, Tumor-Stroma-Bevölkerung verfolgt, aufgezählt und auf der Grundlage Marker Färbung charakterisiert werden zu erkennen. ¹

Einleitung

Das Verständnis der Gewebeentwicklung und Reparatur ist wichtig, um die Aufklärung beteiligten zellulären Komponenten in der Wundheilung, ^2,3 regenerativen Medizin, Entwicklungsbiologie und Tumorbiologie. Unter Umständen, der Reparatur, zahlreiche Zelltypen zu infiltrieren das umgebende Mikromilieu in Vaskularisation, ECM-Ablagerung, Proliferation und Umstrukturierung des Gewebes zu unterstützen. Zellulären Faktoren und Phänotypen kann basierend auf Multi Multiplex-Marker, die die Lokalisierung identifizieren, Differenzierungsstatus und die Interaktion zwischen Zellkomponenten innerhalb des untersuchten Mikro identifiziert werden. Hier beschreiben wir die ....

Protokoll

Syngene Murine Knochenmarktransplantation (KMT), wie von institutionellen IACUC Protokolle zugelassen (Hinweis: Der Erfolg dieses Protokoll erfordert den Einsatz aller markierten Zelltyp (en) als Ziel für die multispektrale Analyse und die nachgelagerten Analyse zu erleichtern, kann man die genetische nutzen oder stabilen Zellmarkierung. Wir schlagen vor, dass jede Zelle, Gewebe, Organ-oder-zu-sein kann zu einem Transplantationsmodell und die Transplantation kann so viele einzigartige markierten Populationen wie der Forschung für nützlich erachtet enthalten angewendet werden. Zusätzlich Multi-markierten Zellsystemen , wie sie in transgenen Mäusen gef....

Ergebnisse

Mit einem multispektrale Imaging-Technik, um Tumore in unserem BMT transgenen Mausmodell eingepflanzt zu analysieren, können wir Stromatumoren Komponenten, die von Knochenmark Herkunft zu erkennen. Die Anfangs BMT wurde 3 Wochen nach der Transplantation mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 1) bestätigt. Orthotop injiziert unmarkierten Eierstock-Tumoren nach Transplantation BMT Bestätigungen wurden herausgeschnitten und Formalin fixiert 6 Wochen nach der ersten Tumorinjektion. Paraffin eingebetteten T.......

Diskussion

Hier beschreiben wir die Anwendung der multispektralen Bildgebung beschreiben wir, wie multispektrale MIMicc-Abfrage der Multiplex-Zellmassen, die Knochenmark Stromazellen Komponenten der Tumor-Mikroumgebung zu analysieren, aber diese Methode und Konzept kann auf die Entschlüsselung anderen zellulären Elemente, die eine komplexe Komposition angewendet werden Gewebe, wie sie bei Wundheilungsreaktionen oder während eines regenerierbaren Gewebes gesehen. In diesen Experimenten verwenden wir transgene Mäuse fluoreszenz unte.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
.2 μ m Filter	Fisher	09-740-35A
10 ml Köderverschluss	BD	309604
25 G Nadel	Cardinal	BF305122
40nm Filter	BD	352340
50 ml konischer	Schlauch Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Deckgläser	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Messschieber Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	Invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulinnadel	BD	329424
Maleinsäure	Acros	100-16-7
Feuchtigkeitskammerbox	Evergreen	240-9020-Z10
Eindeckmittel	dako	S3023
Nagelhärter	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer *0,2 % Tween-20 zu 1x Lösung zur Blockierung des Puffers mit 2 %BSA/2 %FBS hinzufügen. Rühren und filtrieren. Antigen-Retrieval-Puffer: Maleinsäure 14,51 g NaCl 10,95 g NaOH-Pellets (bis 7,5 pH) 9+g Destilliertes Wasser 250 ml Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Lösung, 0,05% Tween 20, pH 9,0) Tris Base 1,21 g EDTA 0,37 g Destilliertes Wasser 1000 ml (100 ml zur Herstellung von 10x, 50 ml zur Herstellung von 20x) Tween 20 0,5 ml Natriumcitratpuffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0) Trinatriumcitrat (Dihydrat) 2,94 g Destilliertes Wasser 1000 ml HCl (pH-Wert auf 6,0 einstellen) 1N Tween 20 0,5 ml *3 Monate bei RT oder bei 4 &/deg; C für längere