يوضح هذا المقال فيديو مجموعة المتابعة، والإجراءات اللازمة لتصحيح أجسام الخلايا وكيفية تنفيذ تسجيلات المشبك الحيوية من خلايا العقدة في جبل لالجامع الماوس للشبكية. هذا الأسلوب يسمح التحقيق في مساهمة الدقيق للمدخلات متشابك مثير والمثبطة، وحجمها النسبي وتوقيت لالتشويك العصبية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنفيذ المشبك الحيوي مع المواصلة متشابك والاصطناعية في خلايا الشبكية العقدة ماوس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
خلايا العقدة هي الخلايا العصبية الناتج من شبكية العين ويعكس نشاطهم دمج مدخلات متشابك المتعددة التي تنشأ من الدوائر العصبية المحددة. تقنيات المشبك التصحيح، المشبك في الجهد وتكوينات الشبك الحالية، وتستخدم عادة لدراسة الخصائص الفسيولوجية للخلايا العصبية لتوصيف ومدخلاتها متشابك. على الرغم من أن تطبيق هذه التقنيات هو غنية بالمعلومات، فإنها تشكل القيود المختلفة. على سبيل المثال، فإنه من الصعب تحديد كيفية التفاعل الدقيق للمدخلات مثير والمثبطة تحديد الانتاج استجابة. لمعالجة هذه المسألة، استخدمنا تقنية تعديل الحالي المشبك، المشبك دينامية، وتسمى أيضا تصرف المشبك 1، 2، 3 ودرست تأثير المدخلات متشابك مثير والمثبطة على استثارة الخلايا العصبية. هذا الأسلوب يتطلب حقن التيار في الخلية وتعتمد على ردود الفعل في الوقت الحقيقي من غشاء المحتملة لها في ذلك الوقت. وinjecteيتم احتساب د الحالي من المواصلة محددة سلفا متشابك مثير والمثبطة، إمكانات انعكاس وإمكاناتهم الخلية غشاء حظية. ، ويوضح التفاصيل بشأن إجراءات تجريبية التصحيح لقط الخلايا لتحقيق تكوين خلية كاملة وتوظيف تقنية المشبك دينامية في هذه المقالة الفيديو. هنا، نقدم لك مجموعة من الردود من خلايا الشبكية العقدة الماوس لمختلف الطول الموجي تصرف تم الحصول عليها من التجارب الفسيولوجية في ظروف التحكم أو في وجود مخدرات. وعلاوة على ذلك، نقدم لك مجموعة من استخدام المواصلة مثير والمثبطة اصطناعية تم إنشاؤها باستخدام وظائف ألفا للتحقيق في استجابات الخلايا.
المقدمة
شبكية العين هي الأنسجة العصبية شبه شفافة بطانة الجزء الخلفي من العين. العديد من الدراسات استخدام شبكية العين كنموذج للتحقيق الخطوات الأولى في المعالجة البصرية وآليات إشارات متشابك. منذ الشبكة الشبكية في إعداد كامل جبل لا يزال سليما بعد تشريح، لأنها تمثل نظام مثالي لدراسة التفاعلات متشابك كما ردودها الفسيولوجية هي مشابهة جدا لفي ظروف فيفو. وهكذا، وذلك باستخدام شبكية العين معزولة يمكن دراسة خصائص الخلايا العصبية وذلك باستخدام تقنيات المشبك التصحيح (على الاستعراضات على هذه التقنية، نرى 6،9،13). تحديد مساهمة الدقيق للدوائر والناقلات العصبية إلى استجابة الخلايا العقدية المحددة، ومع ذلك، وعادة ما أعاق وكل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تعيين ما يصل العامة وتحضير الأنسجة
- الحفاظ على الماوس في الظلام لمدة 30 دقيقة (تهدف إلى تقليل مستوى الإجهاد بها). في الوقت الذي تنتظر، وإعداد 1 لتر من حل خارج الخلية. أول حل 1.9 غرام من بيكربونات الصوديوم في نصف لتر من الماء ملي-Q. يتم الحفاظ على درجة الحموضة له عند 7.4 بواسطة محتدما مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2. بعد خمس دقائق، ويحل 8.8 غرام من أميس متوسطة في 100 مل من الماء ملي-Q، إضافة إلى حل بيكربونات الصوديوم، وأعلى ما يصل إلى 1 L مع الماء ملي-Q وتخلط جيدا. إبقاء هذا الحل carboxygenated لبقية التجربة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وتتجلى مساهمة مصادر مختلفة من المدخلات المثبطة لاستجابات الخلايا العقدية من خلال تطبيق مختلف الطول الموجي تصرف. وقد تم الحصول على هذه الموجات مع المثيرات من الإنارة مختلفة في الظروف العادية وبحضور TTX، وهو الجهد بوابات نا + قناة مانع يمنع عمل جيل محتمل فقط في مجموعة فرعية من interneurons الشبكية المثبطة. الشكل 2A يدل على الاستجابة ممثل لحقن سجلت مثير والمثبطة الطول الموجي تصرف ردا على التحفيز مع بقعة سوداء صغيرة على خلفية رمادية في الظروف العادية. عندما.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نقدم لك مجموعة من استخدام المشبك دينامية لتقييم تأثير هذه النسبة، وتوقيت قريب من الإثارة وتثبيط على الشبكية الناتج الخلايا العقدية. المشبك دينامية يجعل من استخدام المحاكاة الحاسوبية لإدخال المواصلة متشابك المسجلة من الناحية الفسيولوجية أو اصطناعية في الخلايا العصبية الحية. توفر هذه المنهجية أداة تفاعلية التي المواصلة يمكن تعديل وحقنها في الخلايا العصبية لحساب تأثيرها على الاستجابات العصبية. الطول الموجي تصرف يمكن الحصول عليها من التجارب التي تستخدم مؤثرات بصرية لتنشيط خلايا مس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد وافق جميع الإجراءات الأولى من قبل لجنة أخلاقيات رعاية الحيوان من جامعة سيدني، ثم أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للقانون الأسترالي من الممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات للأغراض العلمية (الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا ).
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المجلس الأسترالي للبحوث (ARC DP0988227) وبحوث العلوم الطبية الحيوية مبادرة منحة من الانضباط في العلوم الطبية الحيوية، جامعة سيدني. المعدات تصحيح مكبر للصوت المشبك EPC 8 تم تمويله من قبل صندوق بدء التشغيل من الانضباط في العلوم الطبية الحيوية، جامعة سيدني. تم شراء معدات InstruTECH دوا 8 +8 نظام الحصول على البيانات مع الصناديق من مؤسسة ريبيكا كوبر L. وصندوق بدء التشغيل من الانضباط في العلوم الطبية الحيوية، جامعة سيدني. ونود أن نشكر المراجعين المجهولين للحصول على اقتراحات بصيرة وتعليقاتهم.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم
الشركة
رقم فهرسي
التعليقات
HEPES اللامائيأنابيب نظام
| reagent< / strong> | |||
| Isoflurane استنشاق التخدير | Pharmachem | ||
|---|---|---|---|
| Ames Medium مع L-Glutamate (مسحوق) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate ، ملح | الصوديوم Sigma-Aldrich | ||
| Sigma-Aldrich | |||
| محلول كلوريد المغنيسيوم ( 4.9 مول / لتر) | سيجما ألدريتش | ||
| أدينوزين 5'-ثلاثي الفوسفات (ATP) هيدرات ملح ثنائي الصوديوم | سيجما ألدريتش | ||
| جوانوزين 5'-ثلاثي فوسفات ملح الصوديوم هيدرات | سيجما ألدريتش | ||
| إيثيلين جلايكول بيس (2-أمين &# 8211 ؛ ثيليثير) - <م > N ، N ، N ، N < / EM > - حمض التتراأسيتيك | مسحوق سيجما ألدريتش | ||
| بارافورمالدهيد ، 95٪ | سيجما ألدريتش | ||
| مضاد لوسيفر أصفر ، جزء IgG للأرانب (3 مجم / مل) | إنفيتروجين | ||
| أليكسا فلور 594 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) 2 مجم / مل | Invitrogen | ||
| الفلورسنت الحافظ على وسائل | الإعلام BioFX شركة المختبرات | ||
| <قوي> المعدات < / قوي > | |||
| زجاجية شعرية بنهايات مصقولة باللهب (OD = 1.50 مم ، المعرف = 0.86 مم ، الطول = 15 سم) Warner | Instruments | 64-0794 | |
| زجاج أحادي المرحلة Micr & # 8211 ؛ lectrode مجتذب | Narishinge اليابان | نموذج PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 & m F< / em>ilter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock إبرة تحت الجلد قابلة لإعادة الاستخدام: 30 G | Smith Nephew (أستراليا) | ||
| سخان حل مضمن واحد | Warner Instruments | نموذج SH-27B | |
| جهاز تحكم في درجة الحرارة الأوتوماتيكي | المزدوج Warner Instruments | TC-344B | |
| أوليمبوس مجهر مجسم SZ61 | أوليمبوس شركة | ||
| أوليمبوس المجهر BX50WI: مع هدف 40X | شركة أوليمبوس | ||
| 0-30 فولت 2.5 أمبير تيار مستمر امدادات الطاقة | ديك سميث للإلكترونيات | Q1770 | |
| كاميرا مجهرية رقمية ProgResMF بارد | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp مكبر للصوت EPC 8 | الحصول على البيانات HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8 + 8 | HEKA Elektronik | ||
| الكمبيوتر: DELL | Dell Corporation | ||
المراجع
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
