Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в крови. Нейтрофилы обладают транскрипционно регулируется функций, таких как производство провоспалительных цитокинов и торможению апоптоза. Эти функции могут быть изучены с методом, представленные здесь, которые позволяют обнаружения и количественного ядерного фактора методом проточной цитометрии в изолированных ядрах
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Простой и эффективный метод для обнаружения ядерных активация фактора в человеческих нейтрофилов с помощью проточной цитометрии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови. Эти клетки являются первыми появляются на участках воспаления и инфекции, став таким образом первой линией обороны против вторжения микроорганизмов. Нейтрофилы обладают важными антимикробной функции, такие как фагоцитоз, высвобождение литических ферментов, продукцию активных форм кислорода. В дополнение к этим важным функциям защиты, нейтрофилы выполнять другие задачи, в ответ на инфекцию, таких как производство провоспалительных цитокинов и торможению апоптоза. Цитокины привлечь другие лейкоциты, которые помогают очистить инфекции, и ингибирование апоптоза нейтрофилов позволяет жить дольше на месте инфекции. Эти функции регулируются на уровне транскрипции. Однако, так как нейтрофилы являются короткоживущими клетки, исследование транскрипционно регулируется ответы в этих клетках не может быть выполнено с традиционными методами генной репортер так как нет эффективностиcient методы нейтрофилов трансфекции. Здесь мы представляем простой и эффективный метод, который позволяет обнаружения и количественного ядерного фактора в изолированных и immunolabeled ядер методом проточной цитометрии. Мы описываем методы, чтобы изолировать чистую нейтрофилов периферической крови человека, стимулируют эти клетки с анти-антител к рецептору, изолировать и immunolabel ядер, ядер и анализа методом проточной цитометрии. Этот метод был успешно использован для обнаружения NF-kB и Elk-1 ядерных факторов в ядрах из нейтрофилов и других типов клеток. Таким образом, этот метод представляет собой вариант для анализа активации транскрипционных факторов в изолированных ядрах из различных типов клеток.
Введение
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови 1. Во время воспаления и инфекции нейтрофилы являются первыми клетками появляются на пораженные места, где они выступают в качестве первой линии обороны 2. Нейтрофилы обладают антимикробным несколько механизмов 3, включая фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода, выделение литических ферментов дегрануляцию и производство провоспалительных цитокинов 4,5. Нейтрофилы являются недолговечными клеток, которые получают быстро активировать с помощью сигналов от различных рецепторов клеточной поверхности. Несмотря на то, нейтрофилы были рассмотрены ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выделение нейтрофилов (ПМН) из крови человека
- Используйте около 20 мл крови человека с гепарином (10 ЕД / мл) в качестве антикоагулянта. Кровь была собрана из взрослых здоровых добровольцев venopuncture. Все эксперименты проводились при утверждении комитета по биоэтике при институте де-следственной Biomédicas - UNAM.
- Поместите 2 мл 6% декстрана T500 в PBS в 15 мл коническую трубку центрифуги и добавить 10 мл крови. Смешать путем обращения трубки два или три раза и оставьте на 45 мин, чтобы обеспечить оседание эритроцитов.
- В свежем 15 мл коническую трубку центрифуги поставить 5 мл Ficoll-Paque.
- Возьмите лейкоцитов плазмы, об....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Способ очистки описаны здесь обычно обеспечивает нестимулированных нейтрофилов (ПМН) с чистотой более 95% (рис. 1А). Изолированные PMN может быть стимулировано путем сшивания частности рецепторов специфические моноклональные антитела. Мы стимулировали ПМН через рецепторы Fc и интегрины (рис. 1б). Как только стимулировали, ПМН лизируются и ядра изолированы с высокими выходами. Ядра затем immunolabeled для конкретного ядерного фактора, таких как ядерный фактор кВ (NF-kB), со специфическим.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Очистка метод, описанный здесь позволяет изоляции нестимулированных нейтрофилов (ПМН) с чистотой более 95% (оценка микроскопических наблюдений), в течение короткого времени. Иногда нейтрофилы могут быть загрязнены эритроцитов, если последний не лизируются полностью. Это обычно не влияет на технику, так как эритроциты и ПМН можно легко отличить в отличие популяции клеток с помощью проточной цитометрии. Изолированные PMN может быть стимулировано путем сшивания частности рецепторов специфические моноклональные антитела. В .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Нэнси Мора за техническую помощь.
Эта работа финансировалась исследовательским грантам 48573-M и 168098 от Национального совета де Ciencia у Tecnologia, Мексика и грантов IN212308 и IN205311-2 от Direccion генерала де Asuntos дель Личные Academico, Национального автономного университета Мехико, Мексика.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Мексика) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dexton T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monoprincipal | Sigma | S9638 | |
| Двухосновной фосфат | натрия Sigma | S9390 | |
| Бычий сывороточный альбумин (БСА) | Sigma | A2153 | Фракция Кона V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Хлорид калия | Sigma | P9541 | |
| Магния хлорид безводный | Sigma | M8266 | |
| DL- дитиотреитол (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Трипан синий (0,4 % раствор) | Sigma | T8154 | |
| Параформальдегид | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Моноклональное антитело IV.3 | Medarex (Аннандейл, Нью-Джерси) | 025-1 | Человекоспецифичное анти-FcRII (CD32) |
| Моноклональное антитело 3G8 | Medarex (Аннандейл, Нью-Джерси) | 028-2 | Специфичное для человека анти-FcRIII (CD16) |
| Моноклональное антитело TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Бостон, Массачусетс) | Подарено доктором Мартином Хемлером | Специфичное для человека анти-β 1 интегрин (CD29) |
| Моноклональное антитело IB4 | Калифорнийский университет, Сан-Франциско | Пожертвовано доктором Эриком Дж. Брауном | Специфичный для человека анти-β 2 интегрин (CD18) |
| F(ab')2 козий антимышиный IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-конъюгированный F(ab')2 козий антимышиный IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-конъюгированный F(ab')2 козий анти-кроличий IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κ B p50 | Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния) | sc-114 | Кролик поликлональное антитело |
| Anti-NF-κ B p65 | Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния) | sc-109 | Кролик поликлональное антитело |
| EQUIPMENT | |||
| 15-мл центрифужная пробирка | Corning | 430791 | |
| 50 мл центрифуга | Corning | 430291 | |
| центрифуга, Sorvall Настольная | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-метр | Пипетка Corning | 340 | |
| Пипетман P-20 Пипетман | F123600 | ||
| Пипетман Пипетман P-200 | |||
| Пипетман P-1000 | Гемоцитометр Жильсона | F123602 | |
| микроскоп | Фишера Научный | ||
| Микроскоп | Nikon | Eclipse E600 | |
| Инвертированный микроскоп | Инкубатор с | TMS | |
| Fisher Scientific | 2IS-M | ||
| Микроцентрифуга | Eppendorf | 5414C | |
| Проточный цитометр | Becton Dickinson (Франклин Лейкс, Нью-Джерси) | FACScalibur | |
Ссылки
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010). ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
