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方法文章

腺病毒转导初始CD4 T细胞以研究调节性T细胞分化

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DOI：

10.3791/50455

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2013年8月13日

 , 
1Institute for Molecular Immunology, Helmholtz Zentrum München

本文内容

摘要

利用表达柯萨奇腺病毒受体的转基因技术，通过腺病毒介导的基因转移将外源基因导入初始CD4 T细胞，可实现对调节性T细胞分化的分子机制分析 体外.

摘要

调节性T细胞（Tregs）对于维持对自身抗原以及某些外来抗原的免疫耐受至关重要。Tregs可由初始型CD4 T细胞诱导产生 体外 在TGFβ和IL-2存在下通过TCR和共刺激诱导。这一过程对未来治疗具有巨大潜力，然而调控分化的分子及信号通路在很大程度上仍不清楚。

初始T细胞可通过外源基因表达进行操控，但常规方法无法有效靶向T细胞在初次接触抗原前最重要的初始状态。本文提供了一种在初始CD4 T细胞中表达外源基因的实验方案 体外 在诱导Treg分化之前，采用复制缺陷型腺病毒进行转导，并阐述该腺病毒的构建与生产方法。腺病毒可容纳较大的插入片段（最多可达7 kb），并可携带启动子以实现T细胞中高水平且瞬时的过表达。若T细胞表达转基因的柯萨奇腺病毒受体（Coxsackie adenovirus receptor, CAR），则该病毒可高效转导初始小鼠T细胞。重要的是，感染后T细胞仍保持初始状态（CD44低表达）低CD62L高）和静息状态（CD25-CD69-）并可被激活和分化为调节性T细胞（Tregs），其分化行为与未感染细胞相似。因此，该方法能够从最初阶段即对CD4+ T细胞的分化进行操控，确保在初始TCR刺激所引发的早期信号事件导致细胞发生最终导向Treg分化的改变时，外源基因的表达早已建立。

引言

调节性T细胞（Tregs）对于维持免疫耐受以及抑制过度的免疫反应至关重要。Tregs能够抑制旁观者T细胞的活化。因此，若清除Tregs将导致由活化的T细胞驱动的致命性自身免疫和自我组织破坏1。Tregs在胸腺中CD4单阳性前体细胞经历阴性选择时发育形成，但也可在外周由初始CD4 T细胞在低剂量抗原刺激及次优共刺激条件下分化而来1,2。胸腺来源的Tregs似乎主要抑制针对自身抗原的组织自身免疫反应，而外周诱导的Tregs则被认为在肠道或肺部耐受的建立中发挥重要作用。这些诱导产生的Tregs能有效防止T细胞在黏膜部位识别外来抗原后发生活化，这些外来抗原包括食物和空气中的环境抗原、共生细菌以及过敏原3,4。此外，Tregs在母体对胎儿肽段产生免疫耐受5以及预防移植物抗宿主病6过程中也具有关键作用。然而，Tregs同时也会产生不利影响，例如通过削弱对肿瘤细胞的免疫监视功能而促进肿瘤免疫逃逸7,8。Tregs的标志性特征是表达决定其亚群特性的转录因子Foxp3，这是一种含有叉头结构域的转录因子，对赋予Tregs功能具有必要性和充分性9,10。目前已有部分可诱导Foxp3表达的信号通路被揭示，但T细胞受体激活后调控Treg分化的分子机制仍尚不明确。

Tregs 可被非常有效地诱导 体外 通过在TGFβ和IL-2存在下，使用抗CD3和抗CD28抗体刺激初始CD4 T细胞 11. 由于新产生的调节性T细胞具有功能 体内，调控促进Treg分化的分子在未来的治疗中具有巨大潜力，例如用于哮喘、克罗恩病和器官移植的治疗 11,12相反，通过调节分子以阻断调节性T细胞（Treg）分化的治疗策略，可能为未来联合治疗肿瘤患者的方法提供益处。

体外 分化实验对于描述与T细胞亚群分化相关的分子变化具有重要作用。目前，由于最常用的异位基因表达方法在初始T细胞中均无法有效实施，导致研究人员在探索或筛选调控T细胞分化的基因产物时面临困难。例如，电穿孔和逆转录病毒转导仅在活化的T细胞中有效。与最初的预期相反，通常在静息细胞中有效的慢病毒转导也需通过细胞因子预先活化初始T细胞才能实现13此外，电穿孔过程中cDNA或mRNA的转移涉及细胞膜去极化，这一过程本身可赋予T细胞活化的特征，甚至可能引发Ca²⁺动员2+ 信号转导 并激活NFAT蛋白（未发表观察结果及参考文献） 14同样，在逆转录病毒转导过程中，初始T细胞需要被激活18–40小时。在此期间，细胞分裂过程中核膜发生解体，从而允许逆转录病毒载体随后整合到基因组中。 15因此，这些方法无法研究初始T细胞与抗原相遇时的早期分子调控过程，而该过程正是辅助性T细胞分化的决定性阶段。

腺病毒转导已知可在表达人柯萨奇腺病毒受体（CAR）的多种人类细胞类型中实现外源基因的瞬时表达。该过程无需细胞活化或细胞周期进展。CAR的表面表达对于病毒的有效附着和内化至关重要，而在T细胞特异性启动子驱动下转基因表达截短形式CARΔ1，可使小鼠胸腺细胞和T细胞对腺病毒感染具有易感性。 16重要的是，该转基因并不改变胸腺细胞的发育或 体外 初始CD4 T细胞向不同亚群的分化（数据未显示；参考文献 17）。先前已采用腺病毒介导的转导方法实现T细胞的过表达 17,18 和基因敲低方法 19,20转基因T细胞可从商业可得的DO11.10 tg; CARΔ1 tg小鼠（Taconic, Inc. 及参考文献）中纯化 17）。重要的是，腺病毒转导可在不诱导明显活化迹象的情况下，实现目的基因在初始T细胞中的高表达。T细胞保持初始状态（CD44低CD62L高）和静息状态（CD25-CD69-感染后仍可被激活并分化为调节性T细胞（Treg），其功能类似于未感染细胞。

在将腺病毒质粒转染至HEK293A细胞后，可实现重组腺病毒的制备（图1）。这些质粒通常包含人5型腺病毒基因组，其E1和E3基因已被删除，从而使产生的重组腺病毒不具备复制能力21。HEK293A细胞可弥补这种复制缺陷，因为该细胞系通过稳定整合剪切后的腺病毒基因组而获得永生化特性22。由于腺病毒载体较大（约40 kb），不适合采用传统的限制性内切酶介导的克隆方法，因此我们采用了Gateway系统。目的基因首先被克隆至一个较小的入门载体中，随后可通过λ噬菌体介导的重组反应（LR反应）将其高效转移至腺病毒目的载体中23。我们构建了pCAGAdDu载体，该载体将CAG启动子（鸡β-肌动蛋白启动子与CMV增强子）与一个表达盒相结合，该表达盒包含两侧带有LR位点的原核ccdB筛选标记24。该表达盒与内部核糖体进入位点（IRES）元件相融合，从而可共表达真核感染标记物——增强型绿色荧光蛋白（eGFP），而eGFP又连接了一段包含牛生长激素多聚腺苷酸信号（poly(A)信号）的序列。我们选用CAG顺式调控序列，是因为经典的CMV启动子被发现具有高度激活依赖性，因而不适用于初始T细胞中的基因表达。

在此，我们提供了一种高效的实验方案 体外 Treg 分化及在不激活条件下转导初始 CD4 T 细胞的方法 （图2）该方法可在初始状态的CD4 T细胞分化之前实现外源基因的表达或基因敲低，从而能够在初始TCR刺激后至T细胞亚群定向分化的早期信号事件中，检测目的基因过表达所产生的效应。我们的验证实验还为建立类似的腺病毒应用体系提供了基础，可用于其他T细胞亚群（如Th1、Th2、Th9、Th17、Th22或Tfh细胞）分化过程中的功能研究。

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方案

1. 将目的基因克隆至入门载体

  1. 将目的基因克隆至入门载体中。通过PCR扩增目的基因，随后进行平末端连接至拓扑异构酶偶联载体例如 pENTR/D-TOPO）或限制性酶切介导的克隆可用于此实验步骤。

2. 将目的基因转入 pCAGAdDu 靶向载体

  1. 通过LR重组反应将目的基因从入门载体转移至目的载体（例如 Gateway LR Clonase II 酶混合物）。这将构建出腺病毒表达载体 （图1）.
  2. 线性化10 μg的腺病毒表达载体 PacI 限制性酶切后，将DNA沉淀并重悬于水中，浓度为每100 μl含3 μg DNA。线性化可释放病毒的反向末端重复序列（ITR），该序列是病毒DNA复制及包装至病毒颗粒所必需的。

3. 初始病毒裂解物的制备

  1. 在6孔板的一个孔中接种1 × 105个HEK293A细胞，加入2 ml细胞培养基（DMEM，10% FBS，5% PenStrep），于37 °C、10% CO2培养箱中培养6 – 14小时，使细胞贴壁。此时细胞融合度应约为50%。
  2. 脂质体转染：将6 μl jetPEI试剂加入94 μl 50 μM NaCl中，短暂涡旋。在涡旋过程中将混合液加入100 μl线性化的腺病毒载体中，室温孵育转染混合物15 – 30分钟。

在进行以下所有步骤时，必须遵守针对腺病毒感染的适当生物安全条件！

  1. 将溶液逐滴加入含有 HEK293A 细胞的孔中，在 37 °C 和 10% CO2 条件下培养细胞。若使用荧光标记物，可在转染后 12 - 36 小时用倒置荧光显微镜直观评估转染效率。每 3 天添加 0.5 ml 新鲜培养基。
  2. 每 2 - 3 天使用光学显微镜或荧光显微镜检查细胞病变效应（CPE），表现为细胞变大、变圆并开始脱落的区域，这表明病毒已高效生成。当出现较大范围的 CPE 区域时 （图 3），通常需 24 - 72 小时即可完成全部细胞的感染。
  3. 当所有细胞均出现 CPE 现象，但尚未发生大面积细胞脱落时，通过轻柔吹打使细胞脱落，并将细胞连同上清液（SN，3 - 5 ml）转移至 15 ml 聚苯乙烯管中。
  4. 将含有上清液的细胞置于干冰上冷冻 15 - 20 分钟，随后在 37 °C 快速解冻，以裂解细胞。重复此冻融循环（F/TC）两次。制备好的原始病毒裂解液可置于冰上并在一天内使用，或于 -80 °C 冷冻长期保存。额外的冻融循环将使病毒滴度降低 30 - 50%。

4. 病毒扩增

  1. 在14 cm的组织培养皿中将HEK293A细胞接种并培养至90%汇合度。
  2. 用一半的初代病毒裂解液（1.5–2.5 ml）感染细胞，并将细胞孵育至少36小时。此时几乎所有细胞均应被感染，可通过荧光显微镜观察确认。对于已扩增病毒的再扩增（即 更高浓度的病毒原液，以感染复数（MOI）为50的条件感染HEK293A细胞（参见6.3）。
  3. 细胞应在全部出现细胞病变效应（CPE）但尚未脱落时进行收获。在病毒高效产生的情况下，感染后48小时内即可达到此状态。（如果耗时长达一周，可考虑通过增加4.2步骤中用于感染的腺病毒原液用量，进行一轮扩增。）
  4. 通过轻柔吹打使细胞脱离，并将细胞和上清液转移至50 ml聚苯乙烯管中。在4 °C下以300 x g离心10 min，沉淀细胞。
  5. 去除上清液，并将沉淀重悬于适量培养基或上清液中约 1 ml。
  6. 进行3次冻融循环以裂解细胞，于4 °C、800 x g离心15分钟。收集含有病毒颗粒的上清液（SN）即 将病毒裂解液分装后于 -80 °C 保存。

5. 病毒滴度测定

  1. 在12孔板的每个孔中加入1 ml培养基，接种5个孔，每孔105个A549细胞，静置培养6小时使细胞贴壁。
  2. 取1 μl浓缩的腺病毒（冰上解冻），用培养基进行系列稀释（1:5,000、1:10,000、1:50,000、1:100,000），每孔加入10 μl。留一个孔不感染，用于流式细胞术分析时调整设门。
  3. 36小时后，吸除上清液，用PBS洗涤，并消化细胞（例如使用胰酶消化法）。出于生物安全考虑，建议将细胞在含100 μl 4%多聚甲醛的PBS中室温固定10分钟，再用PBS洗涤一次。
  4. 进行FACS分析以检测感染标志物的表达。以“加入的病毒裂解液体积（μl）”为横坐标，以感染细胞的绝对数量为纵坐标作图 （图4）。确定感染的线性范围，并利用线性范围内的标准曲线，代入x = 1,000 μl计算未稀释病毒每毫升的滴度。

6. T细胞感染

  1. 从 DO11.10 tg; CARΔ1 tg 小鼠中使用 MACS（Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II）或 FACS 分选（CD4+ CD25- CD62L+ CD44-）分离初始/静息 CD4 T 细胞。
  2. 对于小规模实验，用移液器将适量体积的病毒裂解液加入96孔圆底板的一个孔中，以达到50的感染复数（MOI）。
  3. 最多加入 4 x 105 50 μl T细胞培养基（RPMI1640，10% FBS，5% 青霉素-链霉素，5% 丙酮酸钠，1× NEAA，1× MEM必需维生素，1× L-谷氨酰胺，1:250,000 巯基乙醇，10 mM HEPES）中的T细胞终感染体积。
    示例：
    应使用感染复数（MOI）为50来感染3 x 105 T细胞； 病毒滴度为 3 x 109 毫升-1
    病毒体积 = MOI × T细胞数量 / 病毒滴度 = 50 × (3 × 105) / (3 × 109 毫升-1) = 0.005 ml

注意：对于较大数量细胞的感染，使用感染复数（MOI）为50，在聚苯乙烯管（管盖松开）中按每106个初始T细胞165 μl的感染体积进行放大（每管最多3 ml）。

  1. 将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育90分钟。
  2. 在室温下以300 × g离心5分钟，弃上清液，加入200 μl PBS重悬细胞。再次离心并弃去上清液。

（可选：可再次洗涤细胞，以更高效地去除病毒）

  1. 将细胞重悬于 200 μl T 细胞培养基中（不含刺激性抗体以及 IL-2 或其他细胞因子），在 37 °C、5% CO2 培养箱中静置培养 40 小时，以在激活前允许目的基因表达。

7. T细胞活化与极化

  1. 移液加入与细胞数量等量的抗CD3和抗CD28偶联磁珠例如 4 x 105) 转移至小型试剂杯中，加入10倍体积的PBS，置于磁架上2分钟。移除上清液，将磁珠重悬于200 μl 极化培养基中（Treg细胞：T细胞培养基 + 1 ng/ml TGFβ、100 U/ml IL-2）。

注意： 也可使用包被抗CD28和抗CD3抗体的组织培养皿激活细胞，或采用经辐射处理的、负载卵清蛋白323-339肽抗原的BALB/c脾细胞，以DO11.10 T细胞受体特异性方式激活细胞。

  1. 将静置后的细胞按前述方法离心，弃去上清液，并将细胞重悬于 200 μl 含抗 CD3 和抗 CD28 抗体偶联磁珠的极化培养基中。于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 72 小时，期间不更换培养基。

8. T细胞固定与染色用于流式细胞术

  1. 洗涤细胞：在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清液，加入 200 μl PBS 重悬细胞。再次离心并弃上清液。后续所有洗涤步骤均依此操作。
  2. 将细胞重悬于 100 μl 可固定活死细胞染色液中，于 4 °C 孵育 30 分钟。
  3. 洗涤细胞，加入 100 μl PBS 重悬，再加入 100 μl PBS 中的 4% 多聚甲醛，于室温孵育 15 分钟。
  4. 洗涤细胞，将其重悬于 200 μl 冰冷的含 70% 甲醇的 PBS 中，于冰上孵育 30 分钟。

注意：此后可无需采取生物危害防护措施处理细胞！

  1. 配制60 μl的主混合液，包含60 μl PBS + 10 μg/ml Fc阻断剂（抗FCR3，用于阻断非特异性结合）。洗涤细胞，将细胞重悬于40 μl PBS + 抗FCR3中，在室温下孵育15分钟。
  2. 加入20 μl PBS + 抗FCR3，其中含有1 μg PE标记的抗Foxp3抗体，充分混匀后于4 °C过夜孵育。
  3. 用PBS洗涤细胞两次，然后在流式细胞仪上分析细胞。

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结果

病毒制备

为了获得高滴度的病毒，HEK293A细胞在初级病毒生产或病毒扩增过程中的收获时间至关重要。图3展示了具有病毒产生典型视觉特征的代表性荧光图像和相差显微镜图像。在将无插入片段的对照质粒pCAGAdDu转染至HEK293A细胞后10天可观察到细胞病变效应（CPE）。CPE的特征表现为出现细胞变大、变圆并开始脱落的区域，同时感染标志物GFP表达水平较高。CPE的程度反映了病毒生成的效率。表现出类似CPE的细胞培养板可在24至72小时内进行收获，并通过反复冻融循环制备粗制病毒裂解液。随后可通过病毒裂解液的系列稀释测定病毒滴度，以便使用相同的感染复数（MOI）进行感染实验的比较（图4）。在呈线性关系的范围内，可利用回归分析方程计算每毫升未稀释病毒裂解液中的感染性病毒颗粒数量。在本示例中，当x = 1 μl时，滴度为30,016,535 μl-1 ≈ 3 × 1010 ml-1。

评估腺病毒感染对T细胞活化与...

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讨论

病毒的制备与滴定

为了获得最佳的转染效果，线性化载体的质量和用量似乎最为重要。我们发现，初始培养物的过度生长对初级裂解液的制备没有负面影响，因为一旦病毒高效产生，感染过程将迅速进行。然而，插入片段过长可能会影响HEK293A细胞的病毒产量，从而降低效率。实际上，某些开放阅读框被发现会干扰病毒的产生。这些病毒储备液通常可通过多轮扩增得以挽救，仅有少数开放阅读框被发现与病毒产生不兼容。根据我们的经验，在病毒扩增感染后48小时内出现细胞病变效应（CPE），通常可获得约1 × 109 - 5 × 1010 个感染性颗粒/mL的病毒裂解液。

初始T细胞的腺病毒感染

腺病毒感染初始T细胞不会改变T细胞在刺激前后活化状态，这使得该转导系统成为研究T细胞从初始TCR刺激开始分化的有力实验工具。我们已确定，在感染后T细胞静息40小时时，目标基因可实现高效异位表达，此时细胞仍处于初始状态，且无活化迹象。这意味着在后续T细胞活化过程中，目标基因已在早期过表达，能...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Lirui Du 构建 pCAGAdDU 载体，以及 Oliver Gorka 提供固定方案。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒InvitrogenK240020
Gateway LR Clonase II 酶混合物Invitrogen11791020
PacINew England BiolabsR057S
jetPEIPolyplus-transfection101-10N
HEK293A 细胞系InvitrogenR705-07
A549ATCCCCL-185
6 孔板BD Falcon353046
14 cm 组织培养皿Nunc168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1JdgrTaconic FarmsModel Nr. 4285
初始型 CD4+ T 细胞分离试剂盒 IIMiltenyi Biotech130-094-131
DMEMInvitrogen41966-052
FBSPAN Biotech1502-P110704
青霉素-链霉素（PenStrep）Invitrogen15140-122
RPMI 1640LonzaBE12-167F
丙酮酸钠（NaPyruvate）LonzaBE13-115E
非必需氨基酸（NEAA 100x）LonzaBE13-114E
L-谷氨酰胺Invitrogen25030
HEPES 缓冲液（1 M）Invitrogen15630-056
β-巯基乙醇Sigma-AldrichM-7522
MEM 必需维生素混合物（100x）Lonza13-607C
Dynabeads 小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28（用于细胞扩增与激活）Invitrogen114-56D
重组人 TGF-β1R&D Systems240B
Proleukin S（18 × 10⁶ IE）Novartis
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒InvitrogenL-23105
小鼠 BD Fc 封闭剂BD Pharmingen553141
抗小鼠/大鼠 Foxp3 PEeBioscience12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan microRNA 检测试剂Roche Applied Biosystems4427975
LightCycler 480 探针 Master 混合液Roche Applied Biosystems04902343001
TaqMan microRNA 反转录试剂盒Roche Applied Biosystems4366596

参考文献

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