השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף<em&gt; דרוזופילה</em&gt; בידוד זקיק

סיכום

בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה האמצע עד סוף שימושי למגוון מטרות. זקיקים כזה מתפתחים בתרבות, המאפשרת למניפולציות גנטיות ו / או תרופתיות כדי להיות יחד עם מבחני חוץ גופיית פיתוח והדמיה לחיות. בנוסף, זקיקים יכולים לשמש למחקרים מולקולריים, כגון בידוד mRNA וחלבון.

תקציר

oogenesis דרוזופילה או התפתחות זקיק כבר בשימוש נרחב על מנת לקדם את ההבנה של תהליכים ביולוגיים התפתחותית ותא מורכבים. נייר שיטות זה מתאר כיצד לבודד זקיקי האמצע לסוף שלב (שלב 10B-14) ולנצל אותם על מנת לספק תובנות חדשות על האירועים המולקולריים ומורפולוגיים המתרחשים במהלך חלונות הדוקים של זמן התפתחותי. זקיקים מבודדים יכולים לשמש למגוון רחב של טכניקות ניסוי, כוללים במבחני חוץ גופית פיתוח, הדמיה לחיות, ניתוח ביטוי mRNA וניתוח כתם המערבי של חלבונים. זקיקים בשלב 10B (S10B) או במאוחר יהיו להשלים את הפיתוח בתרבות, זה מאפשר לשלב הפרעות גנטיות או תרופתיות עם פיתוח במבחנה כדי להגדיר את ההשפעות של מניפולציות כאלה על התהליכים המתרחשים בתקופות מסוימות של התפתחות. בנוסף, משום שזקיקים אלה מפתחים בתרבות, הם מתאימים באופן אידיאלי למחקרי הדמיה חיות, אשר לעתים קרובות לחשוף את המנגנונים חדשים שלתווך אירועים מורפולוגיים. גם זקיקים מבודדים יכולים לשמש לניתוחים מולקולריים. לדוגמא, שינויים בביטוי הגנים הנובעים מהפרעות גנטיות יכולים להיות מוגדרים עבור חלונות התפתחותיים ספציפית. בנוסף, רמת חלבון, יציבות, ו / או שינוי מצב posttranslational בשלב מסוים של התפתחות זקיק ניתן לבחון באמצעות כתם מערבי מנתח. לפיכך, בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה מספק מקור מידע עשיר לתהליכי שימור נרחב של פיתוח והמורפוגנזה.

מבוא

כל השחלה דרוזופילה מורכבת מ~ 16V ovarioles, או רשתות של תאי ביצה ברצף התבגרות או זקיקים. כל זקיק מורכב מביצית אחת, תאי אחות או תמיכה נגזרים שורת נבט 15, ו~ 650 תאים סומטיים מכונים תאי זקיק (איור 1 א). Oogenesis דרוזופילה מחולק ל14 שלבים מוגדרים מורפולוגית של פיתוח ^1. בכל שלב של התפתחות זקיק הוא ציין פעמים רבות בתוך זבוב אחד, ולכן קל יחסית לבודד מספר ניכר של זקיקים בשלב מסוים.

שלבי האמצע עד סוף של oogenesis (שלבי 10B-14) הם גם מתאימים במיוחד לבידוד במה (איור 1). בשלב 10B (S10B), הזקיק מוארך באופן מלא (כלומר אורכו שווה לזה של שלב 14 (זקיק S14), ראה איור 1 ואיור 2H) ומחצית מאורכו של הזקיק מורכב מתאי אחותואילו המחצית השנייה היא הביצית (איור 1 ג). בשלב זה תאי האחות עוברים שיפוץ אקטין דרמטי, חיזוק אקטין קליפת המוח ויצירת חבילות מקבילות של סיבי אקטין ^2. במקביל, אוכלוסייה של תאי זקיק, המכונה תאים הצנטריפטלי, נודדים בין תאי האחות והביצית, ושתי קבוצות הגבי של תאי זקיק הופכות צוינו לעבור הגירה כדי ליצור את הנספחים הגבי, מנגנוני נשימה צינורי לעובר ³ . תאי האחות אז חוזה (S11), לוחץ תוכן cytoplasmic שלהם לתוך הביצית בתהליך הנקרא תא אחות השלכת, אשר מספק את הביצית עם הגורמים הדרושים לכך שכדי להשלים את העובר (1D איור). תאי האחות ואז לעבור תא מוות (S12-S13) ^4, ותאי הזקיק מפרישים ודפוס קליפת הביצה ⁵ (האיורים 1E-G). לפיכך, בסוף oogenesis עשיר בהתפתחותיים חשובתהליכי morphogenetic ד.

זקיקים מבודדים באמצע בשלב מאוחר (S10B-S14) יכולים לשמש למגוון מטרות, כולל ניתוחים מולקולריים. לדוגמא, ה-mRNA מזקיקים מבוימים יכולה להיות מבודד לRT-PCR, microarray, או RNA-seq ניתוחים. זה מאפשר להסתכל על ביטוי גנים בתוך חלון התפתחותית קצר, עם רק כמה סוגי תאים בהווה, ולקבוע כיצד ביטוי גנים שונה על ידי הפרעות או תרופתיות או גנטיות. גם בידוד שלב ניתן להשתמש להסתכל על חלבונים על ידי מערבי סופג. ניתוח כזה הוא חשוב משום שהוא מאפשר לכמת את רמת ביטוי החלבון בwild-type לעומת מוטציות בשלבים מסוימים. אמנם אפשר להשתמש immunofluorescent מנתח כדי להשיג תוצאות דומות, כימות של הקרינה היא חזקה פחות בשל הדרישות הקפדניות שכל הפיקסלים יהיו בתחום ליניארי של זיהוי ^6. בנוסף, ניתוח כתם מערבי עשוי לספק מידע אחר, כגוןים אם החלבון הוא שונה או שהוא בא לידי ביטוי מאיזופורם אחו ספציפי posttranslationally. גם שלבים מבודדים יכולים לשמש לטיהור חלבונים נוספת, כוללים חלוקה או coimmunoprecipitation subcellular.

גם בידוד זקיק בשלב מסוים יכול לשמש במבחני חוץ גופית פיתוח ⁷ וחייה הדמיה ^8. זקיקי S10B-S13 מבודדים ימשיכו לפתח לS14 בתקשורת תרבות הפשוטה (ראה להלן). חשוב לציין כי זקיקי S10A לא להתקדם דרך תא אחות השלכת באמצעות תנאי התרבות שנדונו בכתב היד הזה. יש לנו בשימוש במבחני חוץ גופית פיתוח S10B להגדיר את התפקיד של פרוסטגלנדינים, שני פרמקולוגית וגנטי, בויסות שיפוץ אקטין באמצעות תא אחות השלכת ופיתוח לקריאה פסקי ^7,9. בדומה לכך, בשלבים מאוחר יותר של התפתחות יכולים גם להיות מבודדים כדי לקבוע את ההשפעות של טיפולים תרופתיים או איש גנטיipulations על תהליכים מסוימים, כגון הגירה הצנטריפטלי תא, הגירת תוספת גב / היווצרות ^10, ומוות של תאי אחות. מבחני מסוג זה יכול לשמש כדי לבצע מסכי אינטראקציה דומיננטיים או מבחני, למשל, בעוד heterozygosity למוטציות בPXT או fascin לבד אין להם השפעה על התפתחות S10B במבחנה, זקיקים מheterozygotes הכפול תא אחות תערוכת הטלת מומים ולחסום בפיתוח ^9.

בנוסף, בגלל S10B-13 יכולים להתפתח בתרבות, כל התהליכים המתרחשים בתקופה זו ניתן לצפות בזמן אמת הדמיה. הדמיה כזו יכולה להתבצע רק באמצעות אור מועבר (אם הוא מעוניין רק בשינויים במורפולוגיה ברוטו) או עם מיקרוסקופיה confocal באמצעות זבובים מהונדסים מבטא בדיקות או זקיקים מוכתמים בצבעי ניאון הדמיה לחיות. הדמיה חיה נמצאת בשימוש כדי לקדם את ההבנה של תהליכים התפתחותיים שלנו באופן משמעותי. אכן, לחיות לדמייןגרם של זקיקים בשלב מאוחר הרחיב את הידע של הגירת תוספת גב, דוגמא של tubulogenesis ^10. אנו מצפים כי הדמיה חיה של תהליכים נוספים בשלב מאוחר, ובכלל זה אקטין דינמיקה בתא אחות השלכת, תספק תובנה חדשות אירועים התפתחותיים אלה. חשוב לציין כי בעוד S10A ושל התפתחות זקיק בשלבים מוקדמים לא ימשיכו להתפתח S14 בתרבות, בשידור חי הדמיה של אירועים המתרחשים באותם שלבים של התפתחות אפשרית באמצעות תנאי תרבות אלטרנטיביים ^11-14 (ראה דיון ליותר מידע).

כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבידוד זקיקים בשלב מאוחר גם עבור פיתוח במבחנה ולחיות הדמיה, או ניתוחים מולקולריים (mRNA ובידוד חלבון).

פרוטוקול

1. הכנת דרוזופילה לפני שלב בידוד

1. הפוך שמרים להדביק רטוב על ידי שילוב של 50 גרם של שמרים יבשים פעילים עם 90 מיליליטר של מים מזוקקים. מערבבים עם מרית לשלב. תן לתערובת לעמוד במשך ~ 30 דקות לפני הערכת עקביות. העקביות צריכה להיות רק עבה מספיק כדי לדבוק בצד של בקבוקון לטוס אבל לא לרוץ למטה בצד. כדי להשיג את המרקם הרצוי ייתכן שיהיה צורך להוסיף עד 10 מיליליטר מים נוספים או כמות קטנה של שמרים יבשים. לאחסן במכל מכוסה ב 4 ° C. השמרים המאוחסנים יכולים לשמש ל~ 1-2 שבועות.
2. לאסוף <זבובי 24 שעות ישנים מבוגרים (שני זכרים ונקבות) של גנוטיפים הרצויים ולשים אותם לתוך בקבוקון עם אוכל לטוס בתוספת ממרח שמרים רטוב מרוחה בצד של הבקבוקון. הטמפרטורה שבה נשמרים הזבובים תשתנה בהתאם לניסוי. בניסויים שיגרתי, זבובים נשמרים בטמפרטורת חדר. בעוד שניסויים שבהם הוא גןשביטוי יתר באמצעות מערכת UAS/GAL4 מאי ¹⁵ דורש שמירה על הזבובים 25 מעלות צלזיוס או יותר, על פי צורך.
3. לספק את הזבובים עם כתם טרי של שמרים להדביק ביום למשך 2 ימים. הערה: כפי שהתפתחות זקיק מוסדרת היטב על ידי המצב התזונתי של נקבת הזבוב, זה חיוני כדי לספק לטוס עם השמרים להדביק עשיר המזינה לפחות 36 שעה לפני לנתיחה.

2. בידוד אמצע לסוף מבוים דרוזופילה זקיקים

1. לאפשר לתקשורת כדי להגיע לטמפרטורת חדר (~ 30 דקות). אם הזקיקים המבוימים הולכים לשמש למבחני חוץ גופיית פיתוח, טרי להכין תקשורת IVEM (מדיה של גרייס חרקים, 10% בסרום שור העובר מומת חום, ו1x פניצילין / סטרפטומיצין). אם הזקיקים המבוימים הולכים לשמש לmRNA או בידוד חלבון להשתמש גם החרק של גרייס או מדיה IVEM. חשובה: טמפרטורת מדיה היא קריטית. אם התקשורת היא קרה זה יהיה לשנותגם אקטין וcytoskeletons microtubule ופיתוח בלוק.
2. הרדימי זבובים בבקבוקון yeasted על ידי הזרקת גז CO ₂ ומקום 3-5 זבובים נשיים על כרית לטוס תחת CO _2. חשוב: אל תשאיר יותר נשים מאשר יכול להיות גזור בתקופת זמן 10 דקות על משטח לעוף כמו חשיפה ממושכת לCO ₂ יכול לגרום לעקרות ומוות.
3. מלא גם אחד של צלחת 9-spot עם תקשורת ולמקם אותו על גבי משטח כהה (חתיכת פרספקס השחור עובדת היטב). להתמקד ההיקף לנתח בתחתית הבאר.
4. # 5 מלקחיים דומון באמצעות להרים נקבה אחת ביד אחת (זה נעשה הכי טוב בעזרת היד הדומיננטית). זה בדרך כלל הקל ביותר להרים את הנקבה על ידי כנפיים, רגליים, חזה או למעבר בטן. להטביע את הנקבה בתקשורת מילאה היטב. התאם את המיקוד של המיקרוסקופ בהתאם לצורך.
5. שימוש בזוג נוסף של מלקחיים שנערכו בnondominant היד, לתפוס את הנקבה בקצה הקדמי של הבטןכך שהקצה האחורי ממוקם לכיוון היד הדומיננטית (איור 2 א). הקפד לשמור את הזבוב השקוע בתקשורת.
6. עם היד הדומיננטית, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הציפורן במגזר פיגמנט האחורי ביותר 2 ולקרוע אותו משאר חלל הבטן (איורים 2 ב-C).
7. שימוש במלקחיים ביד הדומיננטית, ללחוץ בעדינות את הקצה הקדמי של הבטן עד לשחלות לצוץ (איורים 2D-E). במידת צורך, הנח את המלקחיים בין שתי השחלות ולמשוך אותם אל מחוץ לגופה.
8. כך או להזיז את השחלות לבאר חדשה עם תקשורת טרי (איור 2F) או להסיר את הפגר למגבת Kimwipe או נייר. זה חשוב במיוחד אם זקיקים להיות מבודדים לפיתוח במבחנה.
9. חזור על פעולה עד 3-5 זוגות של השחלות היו מבודדים. הערה: כל השחלה מורכבת מ~ 16V ovarioles או שרשרות של זקיקים ברצף התבגרות. כל ovarioleהוא הכיל בתוך מעטפת שרירים.
10. באמצעות מלחציים סיכה והמחטים מסופקות עימם, בעדינות לפרק את השחלה על ידי הפעלת המחטים בין ovarioles (איור 2G). לפעמים זה ישחרר את הזקיקים הבודדים גם כן.
11. ovarioles פרט והשלבים מורפולוגיים להבחין בקלות של התפתחות זקיק צריך עכשיו להיות גלוי (איור 2G, השחלה התגרתה מזה). עיין באיורים 1 ו 2H להבדלים מורפולוגיים שניתן להשתמש בם כדי להבדיל בין השלבים השונים. כדי לבודד זקיקים שנמצאים בovarioles שלם ועדיין בתוך מעטפת שרירים, להשתמש במחט לחוצה ovariole בקדמי של הזקיק שקדמו ובאחורי של הזקיק הבא הזקיק של עניין באופן מיידי. זה ישבור את מעטפת השרירים והזקיק של עניין משם כעת ניתן לחתוך מהזקיקים השכנים ללא פגיעה בו.
12. כשלבים בודדים מופרדים, הזז את הזקיקים של עניין, באמצעות פיפטה זכוכית, לבאר חדשה עם מדיה חדשה. הדבר חשוב במיוחד כאשר מבודדים את הזקיקים להתפתחות במבחנה. הערה: חשוב לסחוט את הנורה פיפטה לפני הכניסה לתקשורת כדי למנוע בועות האוויר מהפיזור מחדש של הזקיקים של עניין לאורך כל כן. בנוסף, אם הזקיקים דבקים בפיפטה הזכוכית, פיפטה ניתן precoated עם 3% אלבומין בסרום שור (BSA) על ידי pipetting פתרון BSA מעלה ומטה מספר פעמים ושטיפה עם תקשורת לנתח.
13. ברגע שמספיק זקיקים היו מבודדים, להמשיך בניסויים הבאים.

3. פיתוח במבחנה של S10B זקיקים

1. לבודד זקיקי S10B באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) בתקשורת IVEM. ודא שהזקיקים הם במהירות התרחקו מפסולת. כאשר זקיקים אלו ימשיכו להבשיל, זה important שS10Bs נאספים ל30-60 דקות ולאחר מכן הניח לתקשורת ההתבגרות של בחירה. הערה: S10B צריך להיות מכובד על זהירות מזקיקי S10A (איור 1 ג לעומת 1 ב '), כפי שזקיקי S10A לא בוגרים בתקשורת ותרבות IVEM. בשני זקיקי S10B S10A ו, מחצית מהאורך מורכבת מתאי אחות ואת החצי השני הוא הביצית, אבל בS10B האורך של הזקיק הוא שווה לזה של זקיקי S14.
2. בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר ~ 30 זקיקי S10B לתוך באר של צלחת תרבית רקמת 24 גם. הערה: הקפד לוודא שכל הזקיקים מועברים הם S10B ולא הבשיל לS11.
3. הכן 1 μl של מדיה התבגרות לכל טוב, כלומר תקשורת IVEM בתוספת חומרים כימיים תרופתיים.
4. באמצעות פיפטה * זכוכית משך, להסיר כמה שיותר מדיה מהבאר (שלב 3.2) ככל האפשר, ובמהירות להוסיף מדיה התבגרות של בחירה. הערה: זה חיוני להשתמש פיפס זכוכית משךette כזקיקים מבוימים ניתן לקחת בקלות גם עם טפטפות זכוכית או טיפים פיפטה עם Pipetman.
   * כדי להפוך טפטפות משכה: 1) מחמם את החלק הדק של טפטפות בלהבה של מבער בונזן הארוכה, זכוכית רק עד שהזכוכית מתחילה להתרכך; 2) להעביר באופן מיידי את פיפטה מהלהבה ולמשוך אופקי כדי לצייר את פיפטה לתוך צינור עדין; 3) לשבור כדי ליצור נקודה עדינה. זהירות: השתמש בהגנה על העין שברי הזכוכית עשויים להתעופף.
5. חזור על שלבים 3.1-3.4 לבארות רבות כמו הניסוי דורש.
6. אפשר לזקיקים להתפתח ל> 10 שעה ולהבקיע ההתקדמות התפתחותית בהיקף לנתח. הערה: ניסויים בדרך כלל הבקיע למחרת כדי לאפשר מספיק זמן לזקיקים להתפתח. S10B היא ~ 5 שעות, S11 הוא ~ 30 דקות, S12 הוא ~ 2 שעות, וS13 הוא ~ 1 שעות במשך ב25 C ° ¹ ופיתוח בטמפרטורת חדר ייקח מעט יותר זמן. ניסויים דומים לזה שתוארו על זקיקי S10B יכולים להיותמבוצע באמצעות זקיקי S11-S13.

4. בידוד במה עבור הדמית חיה

1. לבודד את הזקיקים בשלב מאוחר (S10B-14) המבטא את סמן פלואורסצנטי של בחירה באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) בתקשורת IVEM, נע במהירות זקיקים מפסולת.
2. הזז זקיקים של עניין לתוך מדיה חדשה ולאחר מכן להעביר על ידי פיפטה זכוכית לצלחת פטרי תחתון coverslip. תשמור על עצמך כדי להוסיף מדיה, כך שהוא מבעבע באזור התחתון coverslip אבל לא יגלוש.
3. לזמן לשגות סרטים ארוכים יותר, לפעמים יש צורך לשמור על לחות בתוך צלחת פטרי על ידי הוספת Kimwipe מופשלת, טבולה במים, לקצה הפנימי של צלחת פטרי. מניחים את המכסה על ראש.
4. תמונה על מיקרוסקופ הפוכה. החלטה מפורטת תדרוש מיקרוסקופיה confocal. זה הכרחי כדי לאזן את התדר של הדמיה, עוצמת התאורה, ואורך של הדמיה, זה צריך להיות באופן עצמאי הסתדר לכל ליטרכלי abeling ותהליך התפתחותי.

5. בידוד במה לmRNA הכנה

1. לבודד זקיקי שלב בודדים באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) עם או תקשורת של גרייס או IVEM.
2. בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר את השלבים הבודדים של עניין לתוך בארות חדשות עם תקשורת; ניתן לאסוף שלבים מרובים בבת אחת.
3. שמור פעמים אוסף תחת 1 שעות. הזז את הזקיקים, באמצעות פיפטה זכוכית, ל1.5 מיליליטר צינורות microfuge.
4. לסובב את הצינור לזמן קצר במיני microcentrifuge כדי גלולה כל הזקיקים. בעזרת פיפטה משכה את הזכוכית (ראה שלב 3.4) להסיר בזהירות את כל אמצעי התקשורת. הערה: אם אתם משתמשים בmicrocentrifuge בגודל מלאים, לסובב את הזקיקים במהירות נמוכה.
5. הוספה של Trizol 100 μl ולטחון ביד ל~ 20 שניות באמצעות העלי פלסטיק. ספין למטה במהירות מלאה בmicrocentrifuge ולעבור Trizol לנזהר שלא להפריע לכל ד pelleted צינור 1.5 microfuge מיליליטר חדשebris. חנות ב -80 ° C.
6. חזור על שלבים 5.1-5.5 עד מספיק זקיקים התקבלו לניסוי. באופן שיגרתי, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, ו~ 100 S14 זקיקים להניב ~ 10 מיקרוגרם של רנ"א.
7. הפשירו דגימות על קרח. משלב דגימות, לפי העניין, לצינור microfuge אחד ולהביא עד 800 μl Trizol הנפח. להמשיך עם בידוד RNA לפי הוראות היצרן. חשוב: זכור לDNase טיפול RNA הבודד עם DNase RNase ללא.

6. בידוד במה לסופג מערבי

1. מחממים גוש חום ל100 ° C.
2. לבודד זקיקי שלב בודדים באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) עם או תקשורת של גרייס או IVEM. הערה: יש צורך לקבוע באופן אמפירי כמה מזקיק בשלב מסוים יש צורך להתבונן בכל חלבון ספציפי. לחלבונים הביעו מאוד 1-3 זקיקי S10B / טוב מספיק כדי לראות את איתות חזקה על כתם מערבי. עם זאת, חשוב לעשותמדגם מייצג, לוקח זקיקים מנקבות מרובות. לפיכך, 15-20 זקיקים של שלב מסוים הם בדרך כלל שנאספו.
3. הזז זקיקים, באמצעות פיפטה זכוכית, לצינור microfuge 1.5 מיליליטר. ספין בקצרה במיני microcentrifuge לגלולת הזקיקים (ראה שלב 5.4). מוציא בזהירות את כל התקשורת באמצעות פיפטה זכוכית משך (ראה שלב 3.4) ולהוסיף 50 μl של 1x PBS ו50 μl של חיץ 2x Laemmli.
4. לטחון ביד ל~ 20 שניות עם העלי פלסטיק. הערה: עלי פלסטיק ניתן לעשות שימוש חוזר לטחינת דגימות מערביות על ידי שטיפה והמעוקר.
5. מרתיחים את הדגימות עבור 10 דקות בגוש החום.
6. צ'יל בקצרה על קרח וספין במהירות מלאה ל15 שניות בmicrocentrifuge. או מייד להעמיס על ג'ל SDS-PAGE או חנות ב -20 ° C. שים לב: אם הדגימות מאוחסנות, לזכור להרתיח מחדש את הדגימות לפני העמסתי על ג'ל.
7. ביצוע ניתוח כתם מערבי בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים.

תוצאות

כאשר מבודדים את שלבים מסוימים של התפתחות זקיק דרוזופילה זה הכרחי כדי להיות מסוגל להבחין במדויק את שלבי מורפולוגיים השונים. זה קצת מאתגר עבור S10A וS10B, כמו תאי האחות והביצית כל לקחת חצי אורכו של הזקיק בשלבים האלה (איור 1 ב בהשוואה ל1C). עם זאת, זקיקי S10A הם קצרים באורך יותר מזקיקי S10B, כמו זקיקי S10B מוארכים באופן מלא ובכך שווה באורך זקיק S14 (תרשים 1C בהשוואה ל1G). בנוסף, קבוצת משנה של הזקיק או תאים ס...

דיון

זקיק דרוזופילה מורכב ממספר קטן של סוגי תאים, מה שהופך אותו אידיאלי עבור שניהם המורפולוגיים וניתוחים מולקולריים. יתר על כן, בשל המבנה של השחלה, קל יחסית להשיג מספר גדול של שלבים מסוימים של התפתחות זקיק עם היקף ניתוחים נפוץ והכשרה מינימאלית. כמו כל שלב מייצג חלון זמן קצר, בידוד שלב יכול לספק תובנות מולקולריות משמעותיות לתהליכים התפתחותיים המתרחשים בשלב זה. לדוגמא, יש לנו להשתמש בידוד זקיק שלב האמצע לסוף כדי לאפיין את שינויי ביטוי גנים המתרחשים במהלך S10B, S12, S14 ^ו18....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שמרים יבשים פעילים	Genesee Scientific	62-103	כל מקור של שמרים יבשים פעילים הוא בסדר
גרייס s Insect Media	Lonza	04-457F
סרום בקר עוברי מומת בחום	אטלנטה ביולוגי	S11050H	כל FBS מומת בחום צריך לעבוד
10x עט / סטרפטוקוק	Gibco / Invitrogen	15140-122
סיכות ומחטים	טד פלה, בע"	13561-10
צלחת נקודה,	קורנינג	7220-85
#5 מלקחיים של דומונט	כלי מדע עדינים	11252-20
24 צלחות מרובות בארות	בקטון דיקינסון	35 3226	כל צלחת תרבית רקמה עם 24 בארות צריכה לעבוד
כלים תחתונים של כיסוי (35 מ"מ)	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	עובי הכיסוי יהיה תלוי במיקרוסקופ/ מטרה בשימוש
פיפטות זכוכית	קורנינג	7095B-5x (להעברת זקיקים)
פיפטות זכוכית -	קורנינג	ארוך 7095B-9 (לייצור פיפטות משוכות)
עלי לדוגמא (1.5 μ l; RNase/DNase free)	מוצרי מחקר בינלאומיים	199228	כל עלי פלסטיק שמתאים ל-1.5 μ l צינורות מיקרופוגה ניתן להשתמש ב
- Trizol	Invitrogen	15596-018

מ תשע בארות