一种计算机辅助的多电极膜片钳系统

摘要

多电极膜片钳记录是一项复杂的技术。本文展示了如何通过自动化许多实验步骤，加快实验进程，从而在性能和记录数量上实现质的提升。

摘要

膜片钳技术是目前记录单个神经元或其亚细胞区室电活动最成熟的方法。然而，即使是对单个细胞进行记录，获得稳定的记录仍然是一项相当复杂且耗时的过程。通过自动化多个步骤并结合高效的信息显示，可极大地帮助实验人员在更短时间内以更高的可靠性完成更多记录。为了实现大规模记录，我们认为最有效的策略并非完全自动化整个过程，而是简化实验步骤，降低人为错误的发生概率，同时有效整合实验者的经验与视觉反馈。基于上述目标，我们开发了一套计算机辅助系统，将多电极膜片钳实验所需的所有控制功能集中于一个商业化的无线游戏手柄这一单一操作界面上，同时在计算机屏幕上显示与实验相关的信息和操作提示。本文将介绍该系统的各个组成部分，这些组件使我们能够显著缩短达到记录状态所需的时间，并大幅提高同时成功记录大量神经元的可能性。

引言

以微米级精度记录和刺激多个位点的能力，对于实验上更深入理解神经元系统极为有用。为此已开发出多种技术，但唯有膜片钳技术能够实现亚毫伏级分辨率，这对于研究阈下活动和单个突触后电位至关重要。本文介绍了旨在同时记录和刺激大量单个细胞、并具备足够精度以研究神经元连接性的十二电极计算机辅助膜片钳系统的开发。尽管该系统还可用于许多其他应用，但尤其适用于突触连接性的研究，因为一组神经元内部可能存在的连接数量与神经元数量的平方成正比。因此，三电极系统最多可检测六种连接，通常仅能记录到一种连接，而十二电极系统则可检测多达132种连接，并经常能观察到十余种连接（图1）。同时观察数十种连接使得分析小型神经网络的组织结构成为可能，并可推断出无法通过其他方法探测的网络结构的统计特性¹。此外，对多个细胞进行精确刺激还可量化突触后细胞的募集情况²。

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方案

1. 仪器准备

1. 从计算机控制操纵器
   1. 通过串行端口（RS-232）将每个显微操作器控制器连接到计算机。
   2. 通过串口发送用于定位、查询和调整设置的指令。鉴于速度和硬件兼容性问题，建议使用 C/C++ 作为编程语言。
   3. 将操纵器的参考系统标准化，使零位为尽可能靠近电机的位置，正向移动方向为远离电机的方向。
   4. 将显微镜置于其中心位置，即在样本焦平面以上2 mm处（坐标 [0, 0, 2000]）。
   5. 为每个操作器存储局部坐标，以使移液管尖端位于显微镜视野中心可见。此坐标作为每个电极的初始参考点。
2. 可视化电极位置。 在实验过程中能够追踪每个电极的位置非常有用。最直观的方法是采用图形化表示。为此，需要将每个电极的参考系统与显微镜的参考系统对齐。实现这一目标的一种简单方法是：
   1. 将电极尖端移至视野中心。
   2. 储存操纵器各轴和显微镜各轴的位置。
   3. 使用操纵器的x轴执行一次相对较大的移动（1 mm）。
   4. 仅移动显微镜，再次定位尖端位置。
   5. 计算显微镜自上次测量以来的位置变化。这些变化是电极轴运动在显微镜坐标轴上的投影。
   6. 对电极操纵器的 Y 轴和 Z 轴重复步骤 2.3 至 2.5。这可以确....

结果

根据上述方法，我们成功实现了对多达十二个神经元的全细胞记录，同时进行膜片钳的神经元数量几乎达到此前报道的最高数量的两倍。图中展示了在大鼠体感皮层第五层记录到的锥体神经元之间直接突触连接的网络示例。 图6.

对于特定细胞类型，以胞体间距离为函数测定连接概率分布是多电极膜片钳系统可高效完成的一项典型测量¹。近年来，光刺激技术开始被用于获取此类数据，并展现出更高的效率^3,4。然而重要的是，多电极膜片钳系统所获取的数据使研究者能够更全面地绘制所研究神经网络的连接图谱，并实现通过细胞内扩散染料进行的高分辨率染色。在多电极膜片钳实验中，每一个细胞均可被记录和刺激，而其他技术（如光刺激或钙成像）通常难以做到这一点。该特性使研究者能够追踪连接性中的偏差，例如双向连接的高发性，而此类偏差无法通过其他方法测量。通过对所有被研究神经元进行刺激和记录，我们发现神经元不仅倾向于形成双向连接，而且还会聚集成簇。我们的记录尺度还使我们观察到，在具有共同邻近神经元的神经元对之间，连接概率更高，即在采样网络中同时与其他单个神经元相连接的神.......

讨论

人们通常会立即提出一个问题：我们所描述的实验方法成功率如何？高成功率的关键在于充分的准备工作。移液管的尖端开口必须适合所记录的细胞。为避免移液管堵塞，对细胞内溶液进行过滤也非常重要。此外，移液管必须极为洁净且为 freshly pulled（新鲜拉制）。二项分布是可用于理解上述因素如何影响最终产量的最简单模型。对于具备经验并拥有合适设备的研究人员而言，在视觉反馈条件下记录单个神经元的成功率有望达到80%或更高。初学者的成功率通常要低得多，特别是当忽略了关键的准备步骤时。这些成功率在每次实验中所能记录到的细胞数量上的具体体现，可参见图10。未来若要进一步增加同时进行膜片钳记录的神经元数量，可能需要对操纵器进行微型化改进，并提高实验操作的可靠性；这反过来要求对实验细节给予充分关注，但这些目标完全是可行的。

本文所展示系统的多功能性仍在不断探索中，已频繁发现新的应用，特别是在研究细胞外信号与单个神经元活动之间关系方面⁷。当记录细胞之间的距离增大时，解剖学因素变得更为重要。然而，只要切片操作后神经连接保持完整，该系统无疑可用于研究长距.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜	Olympus	BX51WI	40X 浸液物镜
操纵器	Luigs & Neumann	SM-5	使用串行协议
放大器	Axon Instruments	MultiClamp 700B	使用 SDK
相机	Till Photonics	VS 55	BNC 模拟输出
图像采集卡	Data Translation	DT3120	使用 SDK
示波器	Tektronix	TDS 2014	串行通信
数据采集	InstruTECH	ITC 1600
数据采集	National Instruments	PCI-6221	使用库文件 (.dll)
压力阀	SMC	SMC070C-6BG-32
压力传感器	Honeywell	24PCDFA6G
膜片泵	Schego	Optimal