Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость

37.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50646

⸱

8 октября 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

Носовые эпителиальные клетки, полученные с помощью поверхностного скрести биопсии добровольцах, расширены и переносят на тканевых культур вставками. По достижении слияния, клетки выращивают в воздух жидкой фаз с получением культур мерцательного и не ресничных клеток. Дифференцированные носовые культуры эпителиальных клеток обеспечивают жизнеспособные экспериментальные модели для изучения слизистой дыхательных путей.

Аннотация

В пробирке моделей с использованием первичные эпителиальные клетки человека имеют важное значение в понимании основных функций дыхательного эпителия в контексте микробных инфекций или вдыхаемых агентов. Прямые сравнения клеток, полученные от больных населения позволяют охарактеризовать различные фенотипы и анализировать основные механизмы посреднические изменения в функции эпителиальных клеток. Культивирование эпителиальных клеток из трахеобронхиального области человеческого была хорошо документирована, но ограничивается наличием человеческих тканей легких или инвазивности, связанных с получением бронхиальных щетки биопсии. Носовые эпителиальные клетки получают через гораздо менее инвазивных поверхностных носовой скрести биопсий и предметы могут быть биопсию несколько раз без существенных побочных эффектов. Кроме того, нос является точкой входа для дыхательной системы и, следовательно, одним из первых сайтов, чтобы быть подвержены всякого рода воздушно-капельной стресс, таких как микробных агентов, загрязняющие вещества, или аллергены.

Вкратце, назальные эпителиальные клетки, полученные от людей-добровольцев расширены на покрытых пластин культуры ткани, а затем переносили на культуре клеток вставками. По достижении слияния, клетки продолжают быть культивированы в воздух и жидкой фаз (ALI), в течение нескольких недель, что создает более физиологически соответствующие условия. Условия культивирования АЛИ использует определенные средства массовой информации, ведущие к дифференцированной эпителия, который проявляет морфологические и функциональные характеристики, аналогичные человеческого носа эпителия, и с ресничками и слизистых клеток, продуцирующих. Культуры ткани вставки с дифференцированной носовых эпителиальных клеток можно манипулировать в различными способами в зависимости от исследовательских вопросов (лечение фармакологических агентов, трансдукции с лентивирусов, воздействие газов или инфекции с микробными агентами) и анализировали на многочисленных различных конечных точек в пределах от клеточные и молекулярные пути, функциональный чАнгелов, морфология и т.д.

В пробирке моделей дифференцированных человека носовых эпителиальных клеток позволит следователям для решения новых и важных вопросов исследования с помощью органотипической экспериментальные модели, в значительной степени имитировать носовой эпителий в естественных условиях.

Введение

Цель методики

Эпителиальные клетки (ECS) в дыхательных путях являются одними из первых сайтов, чтобы быть непосредственно подвергающихся ингаляционных экологического стресса, таких как патогенов, аллергенов или загрязнителей воздуха. ЭК более структурного барьера: Они действуют в качестве щита, чтобы инициировать и регулировать иммунную реакцию дыхательных 1-3 с помощью выпуска растворимых медиаторов 4-6 и экспрессии лигандов / рецепторов на их Surfac 7-9. В то время как увековечена клеточные линии могут быть использованы в качестве моделей для изучения дыхания ECs в пробирке, они не в состоянии дифференцироваться в популяциях гетерогенных клеточных состоящих из поляризованного мерцательного и слизистых клеток, продуцирующих, подобное тому, что наблюдается в естественных условиях. Подводя итог важные характеристики дыхательного эпителия наблюдается в естественных условиях, первичные ЭК дыхательных путей могут быть использованы. Таким образом, наша цель в том, чтобы оптимизировать наш метод с использованием носовой ECS (НИКС), полученный из добровольцах. В NECs расширены и культивировали в пробирке, что дает модель культуры клеток дифференцированных ИЭС которая имитирует многие из особенностей носовом эпителии видели в естественных условиях.

Обоснование

Использование моделей в пробирке с человеческими первичных ЭК, имитирующих в естественных условиях ситуации - как описано в данном исследовании - дает уникальные возможности для изучения заболеваний конкретные различия ECS, физиологические параметры, связанные с эпителия дыхательных путей, или взаимодействия между ЭК и других типов клеток, такие как дендритных клеток 10, натуральные клетки-киллеры 11 или макрофаги. Несколько существующие методы используют бронхов ECS, которые могут быть получены инвазивно через щеточные биопсии во bronchoscopies, или из иного отбрасываются легочной ткани 12-17. Кроме того, коммерческие источники для получения полностью дифференцированные дыхательных путей человека культуры эпителиальных клеток существует (EpiAirway модель из Маттек, Ashland, штат Массачусетс, Cloneticsот Lonza, Базеле, Швейцария, MucilAir от Epithelix ОРВИ, Женеве, Швейцария), где следователи могут выбрать из различных доноров. Однако из-за ограниченного пула коммерчески доступных эпителиальных клеток, ограниченных или заданным набором параметров, расходы, связанные с коммерческой получения первичной человеческой дыхательных путей ECS, и ограниченный доступ к отбрасываются легочной ткани или недавно полученной человека бронхиальной биопсии ткани, запретить многих исследователей от проведения исследований в полностью дифференцированных ЭК дыхательных путей человека. Таким образом, мы намерены разработать методику, которая будет 1) использовать неинвазивным полученные человека ИЭС, 2) обеспечить протокол, дающий культуры дифференцированного эпителия дыхательных путей человека, и 3) быть воспроизводимым в большинстве настроек лабораторных с существующей инфраструктуре культуры ткани.

Преимущества по сравнению с существующими методами / модели

Получение свежих ИЭС, по сравнению с бронхов или небольшого дыхательных путей ECS, гораздо менее инвазивной, индивидуальныйс может быть биопсию несколько раз без существенных побочных эффектов, и поверхностные носовые скрести биопсии могут быть проведены в пораженных групп населения, которые иначе не соответствуют требованиям научно-исследовательских связанных bronchoscopies. Неинвазивные поверхностные скрести биопсии для получения ИЭС позволяют следователь установить спецификацию донора априори, в том числе возраст, пол, статус заболевания, и т.д. в соответствии с научно-исследовательской целью быть выполнена. Таким образом, при планировании научных исследований следователи не ограничены клинически доступных тканей / эпителиальные образца, покупать дорогие дифференцированные модели клеточных культур от коммерческих поставщиков, или дизайна инвазивных исследований бронхоскопии. Кроме того, легкость получения ИЭС увеличивает способность проводить эксперименты в клетках от разных доноров, что повышает статистическую проверку наблюдаемых результатов. Наконец, нос является одним из первых сайтов, чтобы подвергаться воздействию любого вида воздушно-капельным путем стресса. Таким образом, создание Органотипической впробирке культуры системы, имитирующие назальный эпителий полезны для изучения вдыхания вирусных частиц, загрязняющих веществ, аллергенов, или газов, которые могут быть легко достигнуты с помощью этой системы клеточной культуре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка пластиковая посуда: Пальто плиты

  1. Добавить 500 мкл PureCol (1:100 разбавленный стерильной водой) в каждую лунку 12-луночного планшета.
  2. Инкубировать при 37 ° С в термостате в течение 30 мин, удалить PureCol и промыть HBSS непосредственно перед клеток добавляли в планшет (см. шаг 3.1 ниже).

2. Получение и предварительной обработки Биопсия человека ИЭС

  1. Носовые лом биопсия
    1. Получить поверхностные КЭ, выстилающие носовых раковинах под контролем зрения через 9 мм многоразового полипропилен носовой расширитель (модель 22009) в операционной отоскопа с зеркалах (модель 21700). Это устройство обеспечивает оптимальную визуализацию носовых раковинах и гибкость движения.
    2. Выполните биопсии с предметом, сидящего в вертикальном положении в прямой спинкой с голова наклонена немного назад или лежа в лежачем положении на гинекологическое кресло с.
    3. Вставьте Отоскоп расширитель в ноздрю и уступает TurbiНейт визуализированы с подсветкой.
    4. Вставка стерильный термопластичного кюретки через расширитель с наконечником расширенной дистально к задней части раковины.
    5. Использование мягкое давление на нижней поверхности носовой раковины, кюретка обращается по поверхности слизистой оболочки 5x и отказался. Успешный извлечение клеток слизистой оболочки, проводимых под действием капиллярных сил будет видно в чашке кюреткой.
  2. Поместите образец в 15 мл коническую пробирку, содержащую 8 мл RPMI 1640, транспорт на льду.
  3. Используйте пинцет для извлечения зонда, выбить ткань от носорога зонда с P-1000 пипетки, отбросить зонд
  4. Центрифуга для осаждения (4 ° C, 400 мкг, 5 мин), аспирации супернатант (внимание: тщательное не для аспирации осадок).
  5. Ресуспендируют осадок в 1 мл BEGM с 10 мкл ДНКазы 1 100x.
  6. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
  7. Центрифуга (4 ° С, 400 XG, 5 мин), НЕ аспирации супернатант!

3. SEED Клетки на пластической (день 0)

  1. Снимите PureCol от пластины и промыть ССРХ (см. также шаг 1.2).
  2. Добавить минимальный объем BEGM + + сред (80-100 мкл, пока мениск носителей не появляется в центре лунку) в 1-4 скважин (в зависимости от размера биопсии) пластины с покрытием.
  3. Используйте P-1000 пипеткой осторожно снимите гранулу биопсии ткани из трубы, без аспирационных слишком много средств массовой информации.
  4. Перенесите осадок в середину скважин, держать биопсию вместе как группа клеток, и не распадаются сделать суспензии отдельных клеток. Хороший биопсии дает до 4 скважин, которые могут быть посеяны. Поставьте тарелку в культуре ткани инкубаторе (37 ° C, 5% СО 2,> 90% относительной влажности).
  5. Проверьте через два часа, чтобы гарантировать, что есть достаточно средств массовой информации (не нарушая мениск).
  6. День 1, 24 ч после посева: собрать все неприкрепленных клеток всех скважин (наклона пластины и собирать средства массовой информации с ячеек в P-1000, сСобрать все скважины в 1,5 мл трубки центрифуги).
  7. Центрифуга (4 ° C, 400 XG, 5 мин).
  8. В то время как центрифугирование клеточной суспензии: добавить около 250 мкл BEGM + + и 250 мкл BEGM + медиа смеси клеток, посеянных на день 0.
  9. Повторите шаги 3.1-3.5 для неадгезивных клеток.
  10. День 2-5: изменение медиа клеток в день; добавить 500 мкл среды в каждую лунку, уменьшить количество BEGM + + медиа ступенчато (2 день после посева: 125 мкл BEGM + + плюс 375 мкл BEGM +, день3 после посева и в последующие дни: 73 мкл BEGM + + плюс 427 мкл BEGM +).

4. Расширение клетки в контейнерах

  1. Монитор клетки ежедневно; как только они достигли 80-90% слияния (обычно 5-7 дней после биопсии, если они занимают больше времени они будут не успешно расти) лифт клетки следующим образом: Тщательно аспирата СМИ; добавить 500 мкл 0,25% трипсина на лунку, держать их при 37 ° С, пока клетки не отделяются (обычно это занимает 2-3 мин).
  2. Подготовка необходимостьред объем соевого ингибитора трипсина (SBTI) (750 мкл на 1 мл трипсина) в 15 мл трубки.
  3. Выбить клетки, неоднократно пипетки вверх и вниз по раствора трипсина; передачи отдельные клетки в 15 мл коническую трубку с SBTI.
  4. Промыть все лунки с в общей 1 мл HBSS, добавьте HBSS к трубе с клетками.
  5. Центрифуга для осаждения (4 ° C, 400 мкг, 5 мин), аспирация СМИ, ресуспендируют в 1 мл BEGM + СМИ и вихрь трубку.
  6. Развернуть клеток в T25 или T75 колбу в зависимости от размера гранул (это p1; около двух сливающихся скважин идут в одном T75 колбу, один сливной хорошо достаточно, чтобы один T25, как правило, 2 сливные колодцы, доходность одной T75).
    1. Добавить BEGM + в колбы (5 мл каждый для T75, 3 мл каждый для T25).
    2. Добавить клеточной суспензии в колбы. Передача колбы в инкубаторе для тканевых культур.
  7. 24 часа в сутки после колбу-посев: добавить дополнительные BEGM + СМИ в колбу (3 мл к T25, 10 мл к T75).
  8. поддержания клеток в колбах: Удалить носителя (аспирируйте от угла) и добавьте BEGM + СМИ (5 ml/T25, 20 ml/T75). Средства массовой информации должны быть изменены каждые 2-3 дня. Поддержание клеток в колбе, пока они не около 80% сливной (сплошности не может быть даже в течение всего колбу, обычно это занимает от 7-10 дней; если они не сливающийся через 10 дней они не будут успешно расти).

5. Семенной клеток на тканевой культуры вставками

  1. Извлеките носитель из колбы и добавить трипсина (3 мл для T25, 4 мл для T75 колбу).
  2. Инкубировать при 37 ° С, пока клетки не отделяются (около 2-3 мин).
  3. Подготовка SBTI (750 мкл на 1 мл трипсина> 2,25 мл для T25, 3 мл для T75) в 15 мл трубки.
  4. Выбить клетки лентой колбу и пипетки вверх и вниз и трансфер в конической трубе с SBTI.
  5. Промойте колбу с HBSS (1 мл для T25, 2 мл для T75), добавьте HBSS в 15 мл трубки.
  6. Центрифугадля осаждения (4 ° С, 400 мкг, 5 мин), аккуратно удалите супернатант.
  7. Подготовка пластин: решить, сколько тарелок будут посеяны, маркировать таблички с примеров кода и числа, пассаж (т.е. р2) и дата. Добавить 700 мкл BEGM + СМИ к базисной камеры.
  8. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл BEGM ALI СМИ встряхиванием трубки.
  9. Граф клеток с гемоцитометре (T25 обычно производит около 4 млн. клеток; T75 может иметь до 20 миллионов клеток в зависимости от островка; использовать 1-2 млн. клеток на один 12-луночный планшет) и разбавить клеточной суспензии с BEGM ALI СМИ в общем объеме необходимого на сумму пластин, которые должны быть посеяна (1,2 х 10 6 клеток в 2,5 мл среды на чашку) (Примечание:. Если часть клеток хотите быть заморожены, этикетка трубку и удалить клетки здесь: мы обычно заморозить 2 х 10 6 клеток в 2 мл замораживания средств массовой информации)
  10. Добавить 200 мкл суспензии клеток в апикальной стороне каждой непокрытой клетки Corning 12wellвставить (> это будет около 80,000-150,000 клеток / вставка; 12 мм transwells с 0,4 мкм пор полиэстера (Полиэтилентерефталат (ПЭТ)) мембрана вставки); передать в культуре ткани инкубаторе.
  11. После 24 часов, изменить верхушечный СМИ (200 мкл расширение средний).
  12. Поддержание клеточных культур: Измените СМИ (BEGM АЛИ СМИ; 700 мкл базолатеральная и 200 мкл верхушечный) через день. Вставки должны поддерживаться под флюсом, пока клетки полностью сливающиеся (никаких отверстий в монослоя не могут видеть). В зависимости от количества клеток это обычно занимает от 2-6 дней, если это занимает больше времени клетки, скорее всего, не будет жизнеспособным.

6. Установите Air жидкость только клетки становятся полностью Сливной (когда клетки на Transwells полностью Сливной)

  1. Как только клетки полностью сливающиеся замените обе верхушечные и базолатеральных СМИ с BEGM ALI среде с 500 нм ретиноевой кислоты в течение 48 часов.
  2. 48 ч после добавления ретиноевой кислоты дополнить BEGM ALI СМИ: Подготовка PneumaCult-ALI поддерживающая среда (перечень поручений по итогам производителя): Рассчитайте объем среды, необходимой (для одной пластины обычно 8,5 мл для базальных отсеков); добавить на 1 мл PneumaCult Полная база Средний :

    10 мкл PneumaCult 100x Дополнение обслуживание
    2 мкл гепарина (из 2 мг / мл маточного раствора)
    5 мкл Гидрокортизон (из 96 мкл / мл маточного раствора).

  3. Извлеките все носители и добавить 700 мкл PneumaCult-ALI обслуживания средств массовой информации для базолатеральной стороны только (без средней на апикальной стороне).
  4. Поддерживать клеточных культур в течение 4 недель в АЛИ:
    1. Смены носителя через день (понедельник, среда и график пятницу хорошо работает для нас).
    2. Через неделю в АЛИ, один раз в неделю (по средам) верхушечный поверхность промыть: добавить 200 мкл HBSS в апикальной стороны, держать их в течение 10 мин в инкубаторе, тщательно аспирацииHBSS (9 использовать в стеклянной пипетки, присоединенный к вакуумной ловушке в биологической безопасности, используют 200 мкл подсказки на кончике пипетки для всасывания от HBSS).

Примечание: Изменить советы между пластинами, а также изменения советы при переходе от апикальной поверхности по сравнению с базолатеральная. Примерно через 2 недели в АЛИ, клетки начинают дифференцироваться и появляются реснички. Клеточные культуры достичь полного дифференциации примерно через 4 недели на Али.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

NECs культивировали следующее здесь описано протокол повторного дифференцироваться в гетерогенной слоем ЭК состоит из мерцательного и не ресничных клеток, представляющих ситуацию в естественных условиях (рис. 1). Некоторые из дифференцированных ИЭС являются продуцирующих слизь (клетки окрашивание в синий помощью AB / PAS, Фигурное 1b). Даже при том, что здесь представлены протокол оптимизирован, дифференцировка может меняться в отношении распределения общей популяции клеток

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Респираторные ЭК обеспечить не только физический барьер, чтобы защитить человеческое тело от экзогенного стимулов 20, но и выступать в качестве щита, чтобы инициировать и регулировать дыхательных ответов иммунной защиты 1-3 через секреции растворимых медиаторов или прямых рецептор-лиганд межклеточных. В целях дальнейшего изучения роли ЭК в иммунном ответе, чтобы изучить потенциальные различия между ЭК от больных населения, или для изучения последствий экзогенных факторов стресса на ЭК, важно повтор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Лизу Дейли за полезные входов.

Эта работа была поддержана грантами от Национальных Институтов Здоровья (ES013611 и HL095163), помощника Летно-исследовательский институт медицинской (FAMRI), и Агентство по охране окружающей среды (CR83346301) и не заявит конфликта интересов. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения. Хотя исследование описано в этой статье была частично финансируется Агентством по охране окружающей среды США через соглашение о сотрудничестве CR83346301 с Центром экологической медицины, астмы и легочных биологии в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл, он не был подвергнут Агентства требуется сверстников и обзор политики и, следовательно, не обязательно отражают точку зрения агентства, и никакого официального одобрения следует рассматривать как случайное. Упоминание оторговые марки Ж или коммерческих продуктов не означает одобрение или рекомендацию для использования. Лоретта Мюллер поддержке Швейцарского Национального научного фонда с личным гранта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Носовое зеркалоWelch AllynModel 220099 мм, многоразовое полипропиленовое
Операционный отоскопWelch AllynModel 21700
Rhino probe cell кюветаArlington ScientificSY-96-092сгибаем головку кюветы чуть больше
12-луночных культуральных планшетовCorning3512
Transwell мембранные клеточные культуры вставкиCorning3460
Колба для культуры тканей Corning430639 и 430641T25 и T75 вентилируемая колба
RPMI 1640 среда (с L-глутамином)Gibco11875
Бронхиальные/трахеальные эпителиальные клетки для роста среднихклеток511-500
BEGM Бронхиальная эпителиальная клетка для роста средыLonzaCC-3170В комплекте идет набор из одного флакона со средой и флаконов с добавками.
Бикарбонат натрия 7,5% растворGibco25080Использовать как есть.
NuSerumBD Biosciences355104использовать как есть.
BAMBANKER замораживающий материалBAMBANKER302-14681Использовать как есть.
CoolCell BiocisionHTBCS-136(контейнер для заморозки клеток без спирта CryoPrep)
PureColAdvancedBioMatrix5005-Bразбавить 1:100 стерильной водой (должно быть примерно 0,03 мг/мл)использовать 500 мкм; l/лунка 12-луночного планшета
HBSS с Ca2 и Mg2+Gibco14025
DNAse 1SigmaDN25Растворите в 1,5 мг/мл, что является 100-кратным раствором, добавьте 10 μ л на каждый мл среды
Трипсин, 0,25%, 1х, с фенолом краснымGibco25200-056Использовать при этом
Ингибитор трипсина соевых бобов (SBTI)SigmaT6522Использовать растворенный в HBSS в концентрации 1 мг/мл
Ретиноевая кислотаSigmaR7632Составить 100 мкм; М стоковый раствор (см. ниже), разбавить до 10 мкм; М с абсолютным спиртом, принимать 5 мкм; 1 мл и добавьте его в 1 мл среды BEGM (наш рабочий раствор).

All-trans Retinol имеет коэффициент экстинкции 52 480 в этаноле при 325 нм. Растворите 25 мг в 50 мл абсолютного этанола. Серийные разведения нужно сделать, развести 50 мл запаса в 450 мл абсолютного этанола, взять 50 мл этого, развести в 450 мл абсолютного этанола, взять 50 мл этого, развести в 450 мл абсолютного этанола, и снова взять 50 мл этого, развести в 450 мл абсолютного этанола, взять 100 мл этого и развести в 900 мл абсолютного этанола и считать в спектрофотометре на 325 нм, Затем это число умножается на коэффициент разбавления, затем деленный на коэффициент экстинкции, равный 52 480, дает число в мМ. Сделайте запас 100 мМ (хранить при -20 °°; В) и из этого запаса получают аликвоту 10 мМ, ежедневная потребность ретиноевой кислоты будет составлять 5 мл этой аликвоты 10 мМ в среде 995 мл ALI. Пример: 325 нм показания равны 1,15. 1,15 х 10 000 (коэффициент разбавления) / 52 480 = 0,219 = 219 мМ, делаем из этого 100 мМ запас в абсолютном этаноле.
DMEM с высоким содержанием глюкозы (1x), жидкий, с L-глутамином и пируватом натрияGibco11995
Экстракт гипофиза крупного рогатого скотаGibco13028-014Используется для сред BEGM ALI.
НистатинСигмаN4014-50 мгСоставной раствор 3,3 мг/мл.
Бычья сыворотка альбуминFisher ScientificBP1600-100Составьте раствор 10 мг/мл раствора в миллиQ-воде.
PneumaCult-ALI mediaStemCell5001Поставляется в виде набора из одного флакона среды и флаконов с добавками. Подробнее см. ниже.
Hydrocortisone StemCell7904Растворите 2,4 мг гидрокортизона в 1 мл ddH2O (используется для приготовления 200x Hydrocortisoon stock solution)
Гепарина натрия Соль в PBS (2 мг/мл)StemCell7980Используйте при этом.
Фильтрующие колбы (500 мл)Corning4310970,22 μ m размер пор
Пробирки с фильтром (50 мл)MilliporeSCGP00525Steriflip, 0,22 μ m размер пор
Наконечники для пипеток - ART Barrier TipsМолекулярные биопродукты2139RI, 2069RI, 2179RI
Конические пробирки, стерильные, 15 мл и 50 мл
ddH2O, абсолютный этанол, лед
CO2 инкубатор
рефрижераторная
пипетки для биологической безопасности (P2, P200, P1000), 9 в стеклянных пипетках,
перчатки
лабораторный халат с плотными манжетами
<тр> <тд><ул><ли> 250 мл БЕГМ, включая добавки <тр> <тд><ул><ли> 2 мл экстракта гипофиза крупного рогатого скота (12,5 мг/мл раствора) <тр> <тд><ул>
  • 1 мл нистатина (3,3 мг/мл раствора)
    • среды и используемые растворы: RecipeUsed for
    Общее замечание: всегда нагревайте среду до комнатной температуры
    BEGM media
    • 500 мл BEGM Cell Аппликационная среда с одной аликвотой ретиноевой кислоты <тд> (смешать их пополам и процедить) <тр> <тд><ул><ли> 500 мл БЕГМ Лонза среда с одной аликвотой одноквотных добавок <тд>< ul>
    • переваривание биопсии
    BEGM+ media
    • 50 мл BEGM media
    • поддерживающие клетки на пластике в пластинах (passage0)
    • 10 μ l ретиноевая кислота (рабочий раствор)
    • Засеивающие клетки в колбе (passage1; частично)
    • поддерживают клетки в колбе
    BEGM++ media
    • 50 мл Lonza' s Среды BEGM с добавками
    • посев свежих клеток в 12-луночный планшет на пластике
    • 1 мл Sodium BiCarb
    • поддерживающие клетки в планшетах на пластике (passage0; только частично)
    • 2,5 мл NuSerum
    • посевные клетки в колбе (passage1; частично)
    BEGM ALI media
    • 250 ml DMEM-H
    • Поддержание клеток на трансвелле до того, как они пойдут ALI
    • 75; l BSA (раствор 10 мг/мл)
    200X Hydrocortisoon Stock Solution (96 μ л/мл раствор)
    • В качестве добавки к PneumaCult-ALI Complete Base Medium за последний день в колбе и когда клетки находятся на вставках
    • 4250 μ l растворенный хлорид натрия
    • 540 μ l ddH2O
    • 10 μ l абсолютный этанол
    Фильтруйте раствор через 0,22 μ м фильтровать, аликвотный раствор и хранить при -20°С; C, избегайте дополнительных циклов замораживания/размораживания
    PneumaCult-ALI Complete Base Media
    • 450 мл PneumaCult-ALI Basal Medium
    • Базовая среда для всех трех сред PneumaCult-ALI
    • 50 мл PneumaCult 10x Supplement
    • Среда PneumaCult чувствительна к свету, поэтому всегда держите ее в темноте
    PneumaCult-ALI Поддерживающая средаPer 1 ml PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:ALI культура на вставках
      <ли> 10 μ l PneumaCult 100x Maintenance Дополнение
    • 2 μ l Гепарин (из исходного раствора 2 мг/мл) <тр> <тд><ул><ли> 5 l Гидрокортизон (из 96 μ л/мл исходного раствора)
    <ТД><УЛ><ЛИ> 200 МКМ; l растворенный гидрокортизон < TD> (Это стабильно в течение 2 недель при 2-8 градусах; C или на срок до 6 месяцев при -20 °°; C)
    центрифугаШкафные ,

    Ссылки

    1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
    2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
    3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. , (2012).
    4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
    5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
    6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
    7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
    8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
    9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
    10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. , (2010).
    11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. , (2013).
    12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
    13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89(2009).
    14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).
    15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
    16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462(1987).
    17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
    18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
    19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
    20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
    21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108(2012).
    22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
    23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
    24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. , (2012).
    25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
    26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
    27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
    28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
    29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102(2011).
    30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Больше статей

    Культивирование на границе раздела фаз «воздух-жидкость» (ALI)вставки для культивирования клетокпланшеты для культивирования тканейбиопсия из носа методом соскобасреда BEGM Plusпосев в систему Transwellмукоцилиарная дифференцировкавестерн-блоттинг
    Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость
    Связаться с нами
    Порекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия использования

    Политики

    © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.