Носовые эпителиальные клетки, полученные с помощью поверхностного скрести биопсии добровольцах, расширены и переносят на тканевых культур вставками. По достижении слияния, клетки выращивают в воздух жидкой фаз с получением культур мерцательного и не ресничных клеток. Дифференцированные носовые культуры эпителиальных клеток обеспечивают жизнеспособные экспериментальные модели для изучения слизистой дыхательных путей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В пробирке моделей с использованием первичные эпителиальные клетки человека имеют важное значение в понимании основных функций дыхательного эпителия в контексте микробных инфекций или вдыхаемых агентов. Прямые сравнения клеток, полученные от больных населения позволяют охарактеризовать различные фенотипы и анализировать основные механизмы посреднические изменения в функции эпителиальных клеток. Культивирование эпителиальных клеток из трахеобронхиального области человеческого была хорошо документирована, но ограничивается наличием человеческих тканей легких или инвазивности, связанных с получением бронхиальных щетки биопсии. Носовые эпителиальные клетки получают через гораздо менее инвазивных поверхностных носовой скрести биопсий и предметы могут быть биопсию несколько раз без существенных побочных эффектов. Кроме того, нос является точкой входа для дыхательной системы и, следовательно, одним из первых сайтов, чтобы быть подвержены всякого рода воздушно-капельной стресс, таких как микробных агентов, загрязняющие вещества, или аллергены.
Вкратце, назальные эпителиальные клетки, полученные от людей-добровольцев расширены на покрытых пластин культуры ткани, а затем переносили на культуре клеток вставками. По достижении слияния, клетки продолжают быть культивированы в воздух и жидкой фаз (ALI), в течение нескольких недель, что создает более физиологически соответствующие условия. Условия культивирования АЛИ использует определенные средства массовой информации, ведущие к дифференцированной эпителия, который проявляет морфологические и функциональные характеристики, аналогичные человеческого носа эпителия, и с ресничками и слизистых клеток, продуцирующих. Культуры ткани вставки с дифференцированной носовых эпителиальных клеток можно манипулировать в различными способами в зависимости от исследовательских вопросов (лечение фармакологических агентов, трансдукции с лентивирусов, воздействие газов или инфекции с микробными агентами) и анализировали на многочисленных различных конечных точек в пределах от клеточные и молекулярные пути, функциональный чАнгелов, морфология и т.д.
В пробирке моделей дифференцированных человека носовых эпителиальных клеток позволит следователям для решения новых и важных вопросов исследования с помощью органотипической экспериментальные модели, в значительной степени имитировать носовой эпителий в естественных условиях.
Введение
Цель методики
Эпителиальные клетки (ECS) в дыхательных путях являются одними из первых сайтов, чтобы быть непосредственно подвергающихся ингаляционных экологического стресса, таких как патогенов, аллергенов или загрязнителей воздуха. ЭК более структурного барьера: Они действуют в качестве щита, чтобы инициировать и регулировать иммунную реакцию дыхательных 1-3 с помощью выпуска растворимых медиаторов 4-6 и экспрессии лигандов / рецепторов на их Surfac 7-9. В то время как увековечена клеточные линии могут быть использованы в качестве моделей для изучения дыхания ECs в пробирке, они не в состоянии дифф....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка пластиковая посуда: Пальто плиты
- Добавить 500 мкл PureCol (1:100 разбавленный стерильной водой) в каждую лунку 12-луночного планшета.
- Инкубировать при 37 ° С в термостате в течение 30 мин, удалить PureCol и промыть HBSS непосредственно перед клеток добавляли в планшет (см. шаг 3.1 ниже).
2. Получение и предварительной обработки Биопсия человека ИЭС
- Носовые лом биопсия
- Получить поверхностные КЭ, выстилающие носовых раковинах под контролем зрения через 9 мм многоразового полипропилен носовой расширитель (модель 22009) в операционной отоскопа с зеркалах (модель 21700). Это устройст....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
NECs культивировали следующее здесь описано протокол повторного дифференцироваться в гетерогенной слоем ЭК состоит из мерцательного и не ресничных клеток, представляющих ситуацию в естественных условиях (рис. 1). Некоторые из дифференцированных ИЭС являются продуцирующих слизь (клетки окрашивание в синий помощью AB / PAS, Фигурное 1b). Даже при том, что здесь представлены протокол оптимизирован, дифференцировка может меняться в отношении распределения общей популяции клеток
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Респираторные ЭК обеспечить не только физический барьер, чтобы защитить человеческое тело от экзогенного стимулов 20, но и выступать в качестве щита, чтобы инициировать и регулировать дыхательных ответов иммунной защиты 1-3 через секреции растворимых медиаторов или прямых рецептор-лиганд межклеточных. В целях дальнейшего изучения роли ЭК в иммунном ответе, чтобы изучить потенциальные различия между ЭК от больных населения, или для изучения последствий экзогенных факторов стресса на ЭК, важно повтор.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Лизу Дейли за полезные входов.
Эта работа была поддержана грантами от Национальных Институтов Здоровья (ES013611 и HL095163), помощника Летно-исследовательский институт медицинской (FAMRI), и Агентство по охране окружающей среды (CR83346301) и не заявит конфликта интересов. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения. Хотя исследование описано в этой статье была частично финансируется Агентством по охране окружающей среды США через соглашение о сотрудничестве CR83346301 с Центром экологической медицины, аст....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Носовое зеркало | Welch Allyn | Model 22009 | 9 мм, многоразовое полипропиленовое | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Операционный отоскоп | Welch Allyn | Model 21700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Rhino probe cell кювета | Arlington Scientific | SY-96-092 | сгибаем головку кюветы чуть больше | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 12-луночных культуральных планшетов | Corning | 3512 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Transwell мембранные клеточные культуры вставки | Corning | 3460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Колба для культуры тканей | Corning | 430639 и 430641 | T25 и T75 вентилируемая колба | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| RPMI 1640 среда (с L-глутамином) | Gibco | 11875 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Бронхиальные/трахеальные эпителиальные клетки для роста средних | клеток | 511-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| BEGM Бронхиальная эпителиальная клетка для роста среды | Lonza | CC-3170 | В комплекте идет набор из одного флакона со средой и флаконов с добавками. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Бикарбонат натрия 7,5% раствор | Gibco | 25080 | Использовать как есть. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NuSerum | BD Biosciences | 355104 | использовать как есть. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| BAMBANKER замораживающий материал | BAMBANKER | 302-14681 | Использовать как есть. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CoolCell | Biocision | HTBCS-136 | (контейнер для заморозки клеток без спирта CryoPrep) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PureCol | AdvancedBioMatrix | 5005-B | разбавить 1:100 стерильной водой (должно быть примерно 0,03 мг/мл)использовать 500 мкм; l/лунка 12-луночного планшета | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HBSS с Ca2 и Mg2+ | Gibco | 14025 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNAse 1 | Sigma | DN25 | Растворите в 1,5 мг/мл, что является 100-кратным раствором, добавьте 10 μ л на каждый мл среды | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Трипсин, 0,25%, 1х, с фенолом красным | Gibco | 25200-056 | Использовать при этом | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ингибитор трипсина соевых бобов (SBTI) | Sigma | T6522 | Использовать растворенный в HBSS в концентрации 1 мг/мл | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ретиноевая кислота | Sigma | R7632 | Составить 100 мкм; М стоковый раствор (см. ниже), разбавить до 10 мкм; М с абсолютным спиртом, принимать 5 мкм; 1 мл и добавьте его в 1 мл среды BEGM (наш рабочий раствор). All-trans Retinol имеет коэффициент экстинкции 52 480 в этаноле при 325 нм. Растворите 25 мг в 50 мл абсолютного этанола. Серийные разведения нужно сделать, развести 50 мл запаса в 450 мл абсолютного этанола, взять 50 мл этого, развести в 450 мл абсолютного этанола, взять 50 мл этого, развести в 450 мл абсолютного этанола, и снова взять 50 мл этого, развести в 450 мл абсолютного этанола, взять 100 мл этого и развести в 900 мл абсолютного этанола и считать в спектрофотометре на 325 нм, Затем это число умножается на коэффициент разбавления, затем деленный на коэффициент экстинкции, равный 52 480, дает число в мМ. Сделайте запас 100 мМ (хранить при -20 °°; В) и из этого запаса получают аликвоту 10 мМ, ежедневная потребность ретиноевой кислоты будет составлять 5 мл этой аликвоты 10 мМ в среде 995 мл ALI. Пример: 325 нм показания равны 1,15. 1,15 х 10 000 (коэффициент разбавления) / 52 480 = 0,219 = 219 мМ, делаем из этого 100 мМ запас в абсолютном этаноле. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM с высоким содержанием глюкозы (1x), жидкий, с L-глутамином и пируватом натрия | Gibco | 11995 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Экстракт гипофиза крупного рогатого скота | Gibco | 13028-014 | Используется для сред BEGM ALI. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Нистатин | Сигма | N4014-50 мг | Составной раствор 3,3 мг/мл. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Бычья сыворотка альбумин | Fisher Scientific | BP1600-100 | Составьте раствор 10 мг/мл раствора в миллиQ-воде. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PneumaCult-ALI media | StemCell | 5001 | Поставляется в виде набора из одного флакона среды и флаконов с добавками. Подробнее см. ниже. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hydrocortisone | StemCell | 7904 | Растворите 2,4 мг гидрокортизона в 1 мл ddH2O (используется для приготовления 200x Hydrocortisoon stock solution) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Гепарина натрия Соль в PBS (2 мг/мл) | StemCell | 7980 | Используйте при этом. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Фильтрующие колбы (500 мл) | Corning | 431097 | 0,22 μ m размер пор | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Пробирки с фильтром (50 мл) | Millipore | SCGP00525 | Steriflip, 0,22 μ m размер пор | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Наконечники для пипеток - ART Barrier Tips | Молекулярные биопродукты | 2139RI, 2069RI, 2179RI | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Конические пробирки, стерильные, 15 мл и 50 мл | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ddH2O, абсолютный этанол, лед | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CO2 инкубатор | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| рефрижераторная | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| пипетки для биологической безопасности (P2, P200, P1000), 9 в стеклянных пипетках, | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| перчатки | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| лабораторный халат с плотными манжетами | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
<тр> <тд><ул><ли> 250 мл БЕГМ, включая добавки <тр> <тд><ул><ли> 2 мл экстракта гипофиза крупного рогатого скота (12,5 мг/мл раствора) <тр> <тд><ул>
|
Ссылки
- Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. C....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
