جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو

ملخص

إنقاذ arenaviruses المؤتلف من cDNAs المستنسخة، وهو نهج يشار إلى عكس علم الوراثة، ويسمح للباحثين للتحقيق في دور الجينات الفيروسية منتجات محددة، فضلا عن مساهمة من المجالات الخاصة المختلفة والمخلفات، إلى العديد من الجوانب المختلفة للبيولوجيا الفيروسة الرملية . وعلى نحو مماثل، عكس تقنيات الوراثة في خطوط الخلايا وافقت عليها الهيئة (فيرو) لتطوير لقاح يوفر إمكانيات جديدة لتوليد لقاحات فعالة وآمنة لمكافحة arenaviruses المسببة للأمراض البشرية.

الملخص

تطوير وتنفيذ الفيروسة الرملية عكس علم الوراثة يمثل انفراجة كبيرة في مجال الفيروسة الرملية ^4. استخدام نظم minigenome الفيروسة الرملية المستندة إلى الخلايا جنبا إلى جنب مع القدرة على توليد المؤتلف arenaviruses المعدية مع الطفرات محددة سلفا في الجينوم الخاصة بهم سهلت التحقيق في مساهمة المحددات الفيروسية إلى الخطوات المختلفة لدورة حياة الفيروسة الرملية، وكذلك في استضافة فيروس تفاعلات وآليات الفيروسة الرملية المرضية ^{1، 3، 11.} وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير arenaviruses trisegmented أباح استخدام الجينوم الفيروسة الرملية للتعبير عن الجينات الغريبة إضافية من الفائدة، مما فتح إمكانية المستندة إلى التطبيقات الفيروسة الرملية ناقلات اللقاح ^5. وبالمثل، وتطوير دورة واحدة arenaviruses المعدية قادرة على التعبير عن الجينات مراسل يوفر أداة تجريبية جديدة لتحسين سلامة الأبحاث التي تنطوي على HIGHLY المسببة للأمراض arenaviruses الإنسان ^16. وقد اعتمد الجيل من arenaviruses المؤتلف باستخدام تقنيات الوراثة العكسية القائمة على البلازميد حتى الآن على استخدام خطوط الخلايا القوارض ^7،19، الأمر الذي يشكل بعض العوائق لتطوير إدارة الغذاء والدواء (FDA) المرخصة لقاح أو ناقلات اللقاح. للتغلب على هذه العقبة، ونحن هنا وصف الجيل كفاءة arenaviruses المؤتلف في خلايا فيرو وافقت عليها الهيئة.

المقدمة

Arenaviruses هي فيروسات يلفها مع bisegmented، السلبية تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الجينوم ³ التي تنتمي إلى عائلة الفيروسات الرملية. الجينوم الفيروسة الرملية بترميز أربعة بروتينات بطريقة ambisense من جزأين منفصلين ³ الفيروسية. لشريحة كبيرة (L) بترميز الحمض النووي الريبي بوليميراز RNA التي تعتمد على (L) وحلقة صغيرة (مثيرة للاهتمام حقا جين جديد) البروتين إصبع (Z) التي هي بمثابة القوة الدافعة الرئيسية للفيروس في مهدها. الصغيرة (S) الجزء بترميز البروتين النووي الفيروسي (NP) وبروتين سكري سطح (GP) (الشكل 1).

عدة....

البروتوكول

1. الفيروسة الرملية ترنسفكأيشن الإنقاذ

واستند نظام الإنقاذ لدينا على استخدام كل من البلمرة الثاني البروتين البلازميدات التعبير ترميز البروتين النووي (NP) والحمض النووي الريبي التي تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز (L)، والعوامل العابرة المفعول الفيروسية اللازمة لتكرار الحمض النووي الريبي والتعبير الجيني للجينوم الفيروسة الرملية ^{7، 19،} والبلازميدات قادرة على توجيه التوليف بين الخلايا، عن طريق الحمض النووي الريبي بوليميراز الخلوية I (POL-I) من S و L الأنواع RNA antigenome ^7. في دراساتنا نستخدم التعبير pCAGGs البروتين البلازميد، والذي يس....

النتائج

وسوف يتم تأكيد الانقاذ بنجاح من الفيروسة الرملية البرية من نوع المؤتلف من خلال وجود مستضدات فيروسية باستخدام IFA (الشكل 5). في حالة الفيروسات trisegmented المؤتلف، يمكن تقييم نجاح الانقاذ الفيروسية من خلال مراقبة التعبير GFP بواسطة المجهر مضان (الشكل 6A). وسوف يتم تأكيد نجاح الانقاذ مزيدا من تقييم التعبير الحلاوة (الشكل 6B). وتم الحصول على نتائج ممثل توضح انقاذ ناجحة من الفيروسة الرملية من النوع البري وtrisegmented باستخدام بروتوك.......

المناقشة

أصبح جيل من arenaviruses المؤتلف باستخدام تقنيات الوراثة العكسية القائمة على البلازميد نهج المستخدمة على نطاق واسع للتحقيق في العديد من جوانب مختلفة من علم الأحياء الفيروسة الرملية. نحن هنا توثيق تحسن حاسم في النظام الحالي عن طريق إجراء الفيروسة الرملية عمليات الإنقاذ في خلايا فيرو، مما يسمح للجيل محتمل من المرشحين لقاح وافقت عليها الهيئة ضد arenaviruses وناقلات اللقاح ضد الأمراض المعدية الأخرى.

الإجراءات التجريب.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي>المواد والأساليب < / strong>
< قوي> خطوط الخلايا < / strong> Vero E6 (الخلايا الظهارية الكلى الأخضر الأفريقي) يتم الاحتفاظ بها في 37 & درجة. حاضنة C مع 5٪ CO2< / sub> في DMEM 10٪ FBS 1٪ PS. تتوفر الخلايا من مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ATCC ، رقم الكتالوج CRL-1586). Plasmids < / strong> جميع البلازميدات ، باستثناء hpol-I L ، يمكن زراعتها عند 37 درجة ؛ ج ، لمدة 16-18 ساعة. نوصي بأن تنمو ثقافات hpol-I L عند 30 درجة. ج لمدة 24 ساعة. يتم تحضير البلازميدات باستخدام مجموعة البلازميد ماكسي (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit ، Omega Bio-tek) باتباع توصيات الشركة المصنعة وتخزينها عند -20 درجة مئوية. يتم تحديد تركيز بلازميد الحمض النووي المنقى عن طريق قياس الطيف الضوئي عند 260 نانومتر ، مع تقدير النقاء باستخدام نسبة 260: 280 نانومتر. تعتبر المستحضرات بنسب 1.8-2.0 260: 280 نانومتر مناسبة لأغراض إنقاذ الفيروسات. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تأكيد تركيز البلازميد ونقاوته باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. الفيروسات < / strong> يمكن تنفيذ البروتوكول الموصوف لإنقاذ rLCMV (Armstrong 53b) و rCandid # 1 في ظل ظروف مستوى السلامة الحيوية (BSL) 2. يجب تعقيم المواد الملوثة ، بما في ذلك TCS والخلايا قبل التخلص منها. قد يتطلب إنقاذ فيروسات الساحة الأخرى مرافق BSL أعلى ، لذا يجب اتباع تدابير السلامة / الأمن المناسبة. وسائط وحلول زراعة الأنسجة < / strong >DMEM 10٪ FBS 1٪ PS: < / قوي> 445 مل وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، 50 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين (PS). يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. سيتم استخدام هذه الوسائط لصيانة خلايا Vero. الوسائط المعدية: < / قوي> خليط 2 إلى 1 من OptiMEM و DMEM 10٪ FBS 1٪ PS. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. سيتم استخدام هذه الوسائط أثناء العدوى الفيروسية. 10X محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): < / قوي > 80 جم من كلوريد الصوديوم ، 2 جم من KCl ، 11.5 جم من Na 2< / sub>HPO4< / sub>.7H2< / sub>O ، 2 غرام من KH2PO4. أضف ddH2< / sub>O حتى 1 لتر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة. 1X PBS: < / قوي> تمييع 10X PBS 1:10 مع ddH2< / sub>O. تعقيم بالأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. 2.5٪ BSA< / strong>: 2.5 جم من BSA في 97.5 مل من 1X PBS. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يستخدم هذا كحل حظر ل IFA.