يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن تطبيق الفحص المجهري فائق الدقة القائم على التوطين للحصول على خريطة مكانية (صورة) لتوزيع الجزيئات المفردة الفردية المسماة بالفلورسنت داخل عينة بدقة مكانية تبلغ عشرات النانومترات. باستخدام بروتينات الفلورسنت القابلة للتنشيط الضوئي (PAFP) أو القابلة للتحويل الضوئي (PSFP) المدمجة في البروتينات ذات الأهمية ، أو الأصباغ العضوية المقترنة بالأجسام المضادة أو الجزيئات الأخرى ذات الأهمية ، يمكن للفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري (FPALM) تصوير أنواع متعددة من الجزيئات داخل الخلايا المفردة في وقت واحد. باستخدام النهج التالي ، يتم تصوير مجموعات من أعداد كبيرة (من الآلاف إلى مئات الآلاف) من الجزيئات الفردية في خلايا مفردة وتوطينها بدقة ~ 10-30 نانومتر. يمكن تطبيق البيانات التي تم الحصول عليها لفهم التوزيعات المكانية النانوية لأنواع البروتين المتعددة داخل الخلية. تتمثل إحدى الميزات الأساسية لهذه التقنية في الزيادة الهائلة في الدقة المكانية: في حين أن الحيود يحد من الدقة إلى ~ 200-250 نانومتر في الفحص المجهري الضوئي التقليدي ، يمكن ل FPALM تصوير مقاييس الطول أكثر من ترتيب من حيث الحجم أصغر. نظرا لأن العديد من الفرضيات البيولوجية تتعلق بالعلاقات المكانية بين الجزيئات الحيوية المختلفة ، فإن الدقة المحسنة ل FARM يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لأسئلة التنظيم الخلوي التي لم يكن من الممكن الوصول إليها سابقا بواسطة المجهر الفلوري التقليدي. بالإضافة إلى تفصيل طرق إعداد العينات والحصول عليها ، نصف هنا الإعداد البصري ل FPALM. أحد الاعتبارات الإضافية للباحثين الراغبين في إجراء فحص مجهري فائق الدقة هو التكلفة: الإعدادات الداخلية أرخص بكثير من معظم آلات التصوير المتاحة تجاريا. تشمل قيود هذه التقنية الحاجة إلى تحسين وضع العلامات على الجزيئات ذات الأهمية داخل عينات الخلايا ، والحاجة إلى برامج ما بعد المعالجة لتصور النتائج. نصف هنا استخدام تعبير PAFP و PSFP لتصوير نوعين من البروتين في الخلايا الثابتة. كما تم وصف امتداد هذه التقنية إلى الخلايا الحية.
المقدمة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يرجى ملاحظة ما يلي: يمكن العثور على تمثيل تخطيطي للمكونات البصرية المشار إليها في هذا البروتوكول في الشكل 1.
< p class = "jove_title" >1. تحضير عينة الخلية- خلايا الصفيحة بكثافة محسنة (بالنسبة لخلايا NIH-3T3 ، هذا ما يقرب من 2-5 × 104 خلايا / سم2) في آبار غرفة مكونة من 8 آبار. يجب أن تكون الخلايا مطلية بوسائط كاملة مناسبة لنوع الخلية ، على الرغم من أنه يجب أن تكون الوسائط خالية من المضادات الحيوية وبدون الفينول الأحمر ، مما يساهم في تألق الخلفية. لاحظ أن ظروف تجربة الخلايا ، مثل النطاق الأمثل لأرقام التمرير ، قد تختلف باختلاف خطوط الخلايا الفردية.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يشكل الهيماجلوتينين (HA) الخاص بفيروس الإنفلونزا تجمعات تتراوح أحجامها من عشرات النانومترات إلى الميكرومترات، وتتوضع هذه التجمعات بشكل متغير في نفس الموقع مع الأكتين (الشكل 5). وتؤكد هذه التوزيعات المكانية نتائج التصوير ذات المقياس الأوسع لهذين البروتينين28، واعتماد التوزيعات المكانية لـ HA على الأكتين19. كما يمكن استخدام صور FPALM متعددة الألوان لوصف كثافة هذه التجمعات ومساحتها ومحيطها، ودرجة التوضع المشترك بين النوعين على المقياسين النانوي والميكروي. وتكون دقة الصور التي يتم الحصو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر التصوير فائق الدقة القائم على التوطين العديد من الإمكانات القوية للتصوير البيولوجي. يمثل الطريق من المكونات البصرية الفردية الموضوعة على الطاولة إلى مجهر وظيفي فائق الدقة قادر على تصوير أنواع فلورية متعددة في وقت واحد في عينة بيولوجية عددا من التحديات. بعض جوانب المحاذاة أكثر أهمية من غيرها. نسعى أدناه لتقديم إرشادات للمستخدمين المحتملين الذين يتعاملون مع أصعب جوانب المسار.
خطوات حاسمة
تتطلب دقة الصورة المحسنة التي يوفرها FPALM والتقنيات المماثلة مزيدا من الاهتمام.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
S.T.H. و M.J.M. يحملان براءات اختراع في الفحص المجهري فائق الدقة. يعمل S.T.H. في المجلس الاستشاري العلمي لشركة Vutara، Inc.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يشكروا فيليب أندرسن وماثيو بارنت وشون كارتر على برمجة الكمبيوتر والمساعدة الفنية والمحادثات المفيدة وبات بايارد للمساعدة الإدارية. تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة المعاهد الوطنية للصحة المهنية K25-AI65459 و NIH R15 GM094713 و NSF MRI CHE-0722759 و Maine Technology Institute MTAF 1106 و 2061 ، وصندوق التحسين الاقتصادي في مين.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| غرف LabTek II حبات | Nunc | ||
| الفلورسنت | حبات Invitrogen | F-8801 | للمعايرة حبات |
| Tetraspeck | Invitrogen | T-7279 | أربعة حبات ملونة للمعايرة |
| زيت الغمر الموضوعي | Zeiss | 518F | زيت الغمر لهدف NA العالي (اعتمادا على اختيار الهدف) |
| HPLC المياه | فيشر Scientific | W5-4 | |
| Media | ATCC | 30-2003 | أو Cellgro 10-090 |
| المضادات الحيوية | GIBCO | 15070-063 | |
| مصل | Thermo Scientific | SH30087.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 52887 | |
| Optimem I | GIBCO | 11058-021 | |
| Trypsin | MPBiomedicals | 1689149 | |
| بارافورمالدهيد | فيشر AA433689M العلمي | تنبيه: سامة |
المراجع
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
