通过星形胶质细胞转运体电流的反卷积分析推导谷氨酸清除的时间过程

摘要

我们描述了一种分析方法，用于根据星形胶质细胞中谷氨酸转运体电流的电生理记录，估算谷氨酸在星形胶质细胞膜上的存留时间。

摘要

大脑中谷氨酸转运体密度最高的细胞是星形胶质细胞。谷氨酸转运体在跨膜转运谷氨酸的同时，伴随3个Na⁺和1个H⁺的同向转运以及1个K⁺的反向转运。该转运过程所产生的化学计量电流可通过全细胞膜片钳记录技术在星形胶质细胞中进行监测。所记录电流的时间进程受到星形胶质细胞所暴露的谷氨酸浓度变化过程、谷氨酸转运体的动力学特性以及星形胶质细胞膜的被动电紧张特性共同影响。本文描述了可用于记录星形胶质细胞中谷氨酸转运体电流，并将谷氨酸清除的时间进程从所有其他影响星形胶质细胞转运体电流波形的因素中分离出来的实验与分析方法。本文所述方法可用于估算在健康或疾病状态下，中枢神经系统任何区域的星形胶质细胞膜处，通过光解释放或突触释放的谷氨酸的存留时间。

引言

星形胶质细胞是大脑中最丰富的细胞类型之一，具有星状形态和细小的膜突起，这些突起延伸至神经组织中，并到达邻近的突触连接部位^1,2。星形胶质细胞的细胞膜上密集分布着谷氨酸转运体分子³。在生理条件下，谷氨酸转运体能够迅速在细胞膜外侧结合谷氨酸，并将其转运至细胞质内。通过这一过程，转运体维持细胞外间隙中谷氨酸的基础浓度处于较低水平⁴。位于兴奋性突触附近的星形胶质细胞细小突起中的谷氨酸转运体，恰好处于有利位置，可在突触活动释放的谷氨酸从突触间隙扩散出来时迅速将其结合。通过这种方式，转运体还能限制谷氨酸向突触周围及突触外区域以及邻近突触的溢出，从而减少兴奋性信号在大脑中的空间扩散范围^5-7。

谷氨酸转运是一种生电过程，其化学计量与3个Na⁺和1个H⁺顺其电化学梯度的内流以及1个K⁺的反向转运相偶联⁸。谷氨酸转运还伴随（但非化学计量偶联）一种阴离子电导，该电导对SCN^-（硫氰酸根）具有通透性> NO₃^-（硝酸根）≈ ClO₄^-（高氯酸根）> I^- > Br^- > Cl^- > F^-，但对CH₃SO

方案

1. 切片制备

1. 配制 500 ml 切片/保存液，其成分（单位为 mM）如下：119 NaCl、2.5 KCl、0.5 CaCl₂、1.3 MgSO₄·7H₂O、4 MgCl₂、26.2 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄ 和 22 葡萄糖，渗透压为 320 mOsm，pH 值为 7.4。
2. 使用 250 ml 烧杯制备用于放置脑片的浸没式孵育 chamber，加入 200 ml 切片/保存液，置于 34 °C 水浴中并持续通入 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体进行氧合。
3. 将剩余的切片/保存液保存于玻璃瓶中，置于 4 °C 环境下备用。
4. 使用氰基丙烯酸酯胶水将一小块琼脂（6%，用 ACSF 配制）固定在振动切片机的样品托上，并将该装置存放在 4 °C 环境中。
5. 在开始切片前 30 分钟，将装有切片/保存液的玻璃瓶放入盛有冰块的容器中冷却，并持续通入 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体进行预冷氧合。

注意：以下所述解剖步骤的关键在于速度与精确性。

结果

本文所述分析方法的成功关键在于能否从中枢神经系统任一区域的星形胶质细胞中获得高质量的转运体电流电生理记录。在急性小鼠海马脑片中，由于星形胶质细胞具有较小的胞体（直径 = 10 μm）和明显的细胞核，因此可在Dodt透射光或红外微分干涉（IR-DIC）显微镜下轻易识别（图1）。当向细胞内溶液中加入Alexa 594（50 μM）等荧光染料后，可通过落射荧光、共聚焦或双光子激光扫描显微镜观察到其独特的星状形态（图1）。在电生理特性方面，星形胶质细胞表现为低输入电阻、超极化的膜电位（约-90 mV），且不具备产生动作电位的能力。星形胶质细胞可在邻近神经元的电刺激或光遗传学刺激，以及MNI-L-谷氨酸等笼锁化合物的紫外光解作用下产生电流反应。

可以使用基于Cs⁺或K⁺的细胞内溶液记录星形胶质细胞转运体电流。需要注意的是，Cs⁺作为一种常用的K⁺替代物，虽然能够支持谷氨酸的转运，但会减慢谷氨酸转运体的循环速率^16,17

讨论

本文介绍了一种从星形胶质细胞获取电生理记录的实验方法、一种用于分离星形胶质细胞中谷氨酸转运体电流的分析方案，以及一种通过星形胶质细胞转运体电流推导谷氨酸清除时间进程的数学方法。

分析的成功依赖于能否从星形胶质细胞获得高质量的膜片钳记录，以及用于描述转运体电流的拟合算法的准确性。去卷积分析基于以下两个假设。 (1) 将谷氨酸清除时间过程扭曲为实验记录的转运体电流的多种过程可表示为线性系统。尽管从绝对意义上讲，影响转运体电流的许多因素属于非线性系统（原则上谷氨酸结合与转运均可发生饱和），但实验证据表明其线性范围较宽。因此，在广泛的刺激强度、释放概率和谷氨酸浓度范围内，转运体电流的时间过程与谷氨酸清除的时间过程保持一致。 ^13,14,18尽管该近似在我们的实验条件下似乎是合理的，但在不同实验体系中重复此分析之前，应对其进行验证。 (2) 滤波器的特性不受TBOA（10 μM）存在的影响。这一假设似乎是合理的，因为所有对滤波器有贡献的因素即 转运体动力学、电紧张性滤波以及突触刺激期间跨突触的谷氨酸异步释放等过程不太.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CGP52432	陶克瑞斯	1246
(R,S)-CPP	陶克瑞斯	173
DPCPX	陶克瑞斯	439
LY341495 二钠盐	陶克瑞斯	4062
MSOP	陶克瑞斯	803
NBQX 二钠盐	陶克瑞斯	1044
D,L-TBOA	陶克瑞斯	1223
苦味毒	西格玛	P1675
MNI-L-谷氨酸	陶克瑞斯	1490
Alexa 594	生命技术公司	A10438	可选
阵列电极	弗雷德里克·海尔公司	MX21AES(JD3)
硼硅酸盐玻璃毛细管	世界精密仪器公司	PG10165-4
双级玻璃微电极拉制仪	纳利希格	PC-10
乐泰 404 瞬干胶	特德·佩拉公司	46551
氙灯	拉普光电电子公司	FlashMic
Igor Pro 6	WaveMetrics