Descriviamo un metodo analitico per stimare la durata del glutammato a membrane di astrociti da registrazioni elettrofisiologiche delle correnti trasportatore del glutammato negli astrociti.
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Articolo metodologico
Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti
In questo articolo
Sommario
Abstract
La più alta densità di trasportatori del glutammato nel cervello è trovato in astrociti. Glutammato trasportatori coppia il movimento del glutammato attraverso la membrana con il co-trasporto di Na + e 3 1 H + e la contro-trasporto di K + 1. La corrente stechiometrico generata dal processo di trasporto può essere monitorato con cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti. L'andamento temporale della corrente registrata è modellato dalla decorso temporale del profilo glutammato concentrazione a cui sono esposti gli astrociti, la cinetica di trasportatori del glutammato, e le proprietà elettrotoniche passivi di membrane astrociti. Qui si descrivono i metodi sperimentali e analitici che possono essere utilizzati per registrare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e isolare l'andamento nel tempo della clearance di glutammato da tutti gli altri fattori che determinano la forma d'onda delle correnti trasportatore astrociti. I metodi qui descritti possono essere utilizzati per stimare la durata of flash-Uncaged e sinapticamente-glutammato rilasciato a membrane astrocitici in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale durante salute e di malattia.
Introduzione
Astrociti sono uno dei più abbondanti tipi di cellule nel cervello con morfologia a forma di stella e sporgenze sottili membrane che si estendono per tutta la neuropil e raggiungono limitrofi sinaptica contatti 1,2. Membrana cellulare Le astrociti 'è densamente ricco di glutammato molecole trasportatrici 3. In condizioni fisiologiche, trasportatori del glutammato legano rapidamente glutammato extracellulare a lato della membrana e trasferirlo al citoplasma cellulare. Così facendo, i trasportatori mantenere bassa la concentrazione basale di glutammato nello spazio extracellulare 4. Trasportatori del glutammato nei processi astrocit....
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Protocollo
1. Fetta di preparazione
- Preparare 500 ml di soluzione di affettare / archiviazione contenente (in mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0,5 CaCl 2, 1,3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, e 22 di glucosio, 320 mOsm, pH 7.4
- Utilizzare un bicchiere da 250 ml per preparare una camera di immersione per le fette, riempirlo con 200 ml di soluzione di affettare / archiviazione, scaldarlo a bagnomaria a 34 ° C e la bolla con il 95% di O 2, 5% di CO 2.
- Mantenere il restante affettatura soluzione / memorizzazione in una bottiglia di vetro a 4 °....
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Risultati
Il successo di questo approccio analitico descritto qui dipende criticamente ottenere registrazioni elettrofisiologiche alta qualità delle correnti Trasportatori dagli astrociti in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale. In acute del mouse fettine di ippocampo, astrociti possono essere facilmente identificati sotto Dodt illuminazione o IR-DIC causa del loro piccolo corpo cellulare (Ø = 10 micron) e nucleo prominente (Figura 1). Loro caratteristico morfologia a stella può essere apprezzato con ep.......
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Discussione
Qui si descrive un approccio sperimentale per ottenere registrazioni elettrofisiologiche da astrociti, un protocollo analitico per isolare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e un metodo matematico per ricavare l'andamento nel tempo della clearance di glutammato dalle correnti transporter astrociti.
Il successo della analisi si basa sulla capacità di ottenere alta qualità registrazioni di patch clamp dagli astrociti e sulla precisione dei algoritmi di adattamento uti.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke del programma di ricerca intramurale (NS002986). Come ha scritto il manoscritto e implementato l'analisi di deconvoluzione. JSD ha sviluppato la versione iniziale dell'analisi deconvoluzione e commentato il testo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 sale disodico | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX sale disodico | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotossina | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutammato | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Elettrodi a |
| matrice | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Capillari in vetro borosilicato | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Estrattore per micropipette in vetro a doppio stadio | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 adesivo istantaneo | Ted Pella | 46551 | |
| Lampada Xe | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
Riferimenti
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hip....
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Ristampe e permessi
