세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 현재의 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 수와 겐타 마이신 보호 분석은 전체 세균 집단의 생존 능력을 평가하고 각각의 세균 가능성을 확인할 수 없습니다. 전자 현미경 개별 박테리아의 생존을 결정하고 숙주 세포에서의 지역화에 관한 정보를 제공하는데 사용될 수있다. 그러나 박테리아는 종종 생존 능력의 평가는 어렵게, 전자 밀도의 범위를 표시합니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 분석은 인간의 기본 호중구에 임균의 생존을 평가하기 위해 원래 개발 된, 그러나해야한다어떤 박테리아 숙주 세포의 상호 작용에 pplicable. 이러한 프로토콜은 막 투과 형광 염료 결합 만 액세스 할 수있는 막 투과성 형광 염료 (요오드화 프로피 듐 및 SYTOX 녹색)로, 모든 박테리아를 얼룩 (SYTO9 및 4 ', 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 [DAPI), 생존 할 박테리아. 종래 진핵 세포 permeabilization에, 항체 또는 형광 시약을 세포 외 박테리아를 식별하기 위해 추가된다. 따라서 이러한 분석은 진핵 세포와 내부에 부착 박테리아의 생존 능력을 차별. 프로토콜은 또한 개별 박테리아 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 진핵 세포 마커 형광 항체와 조합 생존력 염료를 사용하여 제공된다. 이 문서에서 설명하는 박테리아의 생존 염료 개별 박테리아의 생존 능력을 평가하고 박테리아가 숙주 세포에서 살아 남기 위치에 관한 정보를 제공하기 위해 기존의 미생물 기술에 민감한 보완 및 / 또는 대안의.
서론
동적 상호 작용과 그들이 거주하는 박테리아와 호스트 사이의 공동 발전이있다. 박테리아 부착 소기관, 분비 시스템, 및 / 또는 호스트 식세포 및 비 식세포 그들의 생산적 감염을 활성화 독소를 생산하는 능력을 진화 해왔다. 박테리아는 또한 인식과 숙주 면역 시스템의 항균 활동을 주장해야합니다. 숙주 면역 시스템은 물리적 및 화학적 장벽, 면역 세포, 보체계 및 체액 성 면역의 다른 구성 요소들을 포함하는 선천성 및 적응 구성 요소로 구성된다. 많은 박테리아가 다층 호스트 면역 반응에 의해 살해 및 통관에 민감하지만, 몇 가지 병원성 및 기회 박테리아가 숙주 세포의 다양한 감염 및 숙주 면역 반응 (1)에 의해 허가를 파괴하는 메커니즘을 진화했다. 임균은 세균성 병원체의 한 예입니다 그는 매우 그 사람의 호스트. N에서 지속하도록되어있다. 임질은 쉽게 비뇨 생식기의 기관, 인두, 결막, 그리고 직장의 점막 상피 세포의 내강 표면을 식민지화한다. 식민지 점막 사이트에서 호중구의 풍부한 모집을 트리거합니다. 호중구는 미생물을 죽이는 항균 다양한 공정을 가지고 전문 식세포 있습니다하지만, N. 임질은 호중구 2-5의 존재하에 생존 할 수있다. 같은 N. 같은 방법 세균성 병원균에 대한 이해
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프로토콜
1. 프로피 디움 요오드 및 SYTO9와 세균 생존 능력을 평가
- 그 박테리아를 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오.
- 회 부드럽게 세포를 헹구 0.1 M 3 - (N-모르 폴리 노) 1 mM의 MgCl2를 (MOPS / MgCl2를 2)를 함유하는 프로판 술폰산 (MOPS)의 pH 7.2.
- 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 세포를 품어.
참고 : 행동이 관심의 렉틴 또는 항체 (그림 1)에 관계없이 생존의 모든 박테리아를 바인딩 것을 보여주기 위해, 숙주 세포의 부재에서, 라이브와 죽은 세균 제어합니다.
- MOPS / MgCl2를 가진 세포를 두 번 씻어.
- 기음 M세포 edia 및 0.5 ㎖ 라이브 / 죽은 염색 솔루션을 추가합니다. 라이브 / 죽은....
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결과
설명 된 프로토콜은 N.의 생존을 검사하는 데 사용되었다 임질은 인간의 기본에 노출 된 후 5,26를 호중구. 호중구는 N. 감염된 임질 및 녹색 형광 생존력 염료 SYTO9 및 빨간색 형광 프로피 디움 아이오다 이드 (도 4A)를 사용하여, 한 프로토콜로 처리. 염료는 우선적으로 숙주 세포의 원형질막 아닌 N.을 투과하는 콜레스테롤 sequesters는 사포닌의 존재하에 첨가 임질 막. 그 박테리아의 세포막 콜레스테롤의 높은 금액을 포함하는 경우에 다른 세제 테스트 할 필요가 있습니다. 모든 N. SYTO9와 임질 얼룩하지만, 손상된 세포막 만 박테리아는 프로피 디움 요오드와 얼룩. 프로피 디움 요오드는 SYTO9 형광을 극복, 그래서 살아있는 박테리아는 녹색과 죽은 박테리아가 27 빨간색 표시가 나타납니다. 일부 세균 종에 요오.......
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토론
DNA는 인간의 세포와 내부에 부착 된 라이브 및 죽은 박테리아를 식별 할 수있는 형광 렉틴과 함께 결합과 생존의 염료를 사용하는 두 개의 프로토콜은 여기에서 소개하고 있습니다. 두 프로토콜 효과적으로 사균의 라이브 판별하기 때문에, 사용하는 프로토콜의 선택은 실험의 목표에 의존한다. 제 1 프로토콜은 생존 불가능한 박테리아 그대로 박테리아를 검출하는 SYTO9를 검출 프로피 듐 요오다 이드를 사용한다. 그림 4a에 도시 N.에 감염된 사람의 호중구에 적용되는 프로토콜 1의 대표 이미지입니다 임질. 이러한 염료는 세포 외 N. 인식하는 렉틴, 대두 응집소와 합하고 임질하지만 형광 결합 박테리아 특이 항체는 대안으로서 사용될 수있다. 프로피 디움 요오드에 의한 SYTO9의 배제가 생존 할 박테리아가 빨간색과 실행 가능한 박테리아가 녹색 형광 형광을 만드는 것이므로 프로토콜 1은 쉽게, 개별 박테리아의 생존 능력을 보여준다. Howeve.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
우리는 원고의 중요한 읽기 아샤 스 미르 노프와 Laura Gonyar 감사합니다. 이 작품은 AKCMBJ 보조금 NIH R00 TW008042 및 R01 AI097312는 NIH T32 AI007046에 의해 부분적으로 지원되었다에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 혈액 수집을 위한 21 G 3/4 나비 바늘 | Becton Dickinson | 367251 | |
| 나트륨 헤파린이 함유된 혈액 채취 튜브 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| 관개용 멸균수 | Baxter | 07-09-64-070 | |
| 덱스트란 500 | 시그마 | 31392 | |
| 염화나트륨 | Fisher Scientific | S641 | |
| 포도당 | Ricca 화학 회사 | RDCD0200 | |
| Dulbecco의 PBS no Ca2+ 또는 Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll 솔루션 | GE 헬스케어 | 17-1440-03 | |
| 아세트산 | 피셔 사이언티픽 | BP2401 | |
| 12mm 원형 유리 커버슬립 | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24웰 플레이트 | Corning Incorporated | 3524 | |
| 풀드 휴먼 세럼 | 시그마 | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| 소 태아 세럼 | 써모 사이언티픽 | SH3007103 | |
| 인간 인터루킨-8 | R& D 시스템 | 208-IL/CF | |
| 걸레 | 시그마 | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 또는 L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 또는 L7012 | |
| 사포닌 | 플루카 분석 | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | 시그마 | D8417 | |
| SYTOX 그린 | 라이프 테크놀로지 | 스 S7020 | |
| 마우스 anti-CD63 | 발달 연구 Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 항체 라벨링 키트 | Life Technologies | A20187 | |
| 혈구계 Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| 펜치 | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + 원심분리기 | Thermo Scientific | 75004377 |
참고문헌
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77(2011).
- Simons, M. P., Nausee....
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재인쇄 및 허가
