Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Секс Стратифицированная нейронов культур для изучения ишемических: Подготовка гибель клеток

12.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50758

⸱

9 декабря 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Colorado School of Medicine, 2Oregon National Primate Research Center, Oregon Health & Science University, 3Department of Pharmacology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Первичные диссоциированные эмбриональные культуры нейронов гиппокампа полезны для изучения сигнальных механизмов, участвующих в гибели нейронов. Определение пола эмбрионов до выделения и диссоциации гиппокампа позволяет получить отдельные мужские и женские культуры, что позволяет исследователю идентифицировать и исследовать сигнализацию клеток, специфичную для пола.

Аннотация

Половые различия в восприимчивости нейронов к ишемическому повреждению и нейродегенеративным заболеваниям наблюдаются давно, но сигнальные механизмы, ответственные за эти различия, остаются неясными. Первичная диссоциированная эмбриональная культура нейронов обеспечивает упрощенную экспериментальную модель, с помощью которой можно исследовать передачу сигналов нейрональных клеток, участвующую в гибели клеток в результате ишемии или заболевания; Тем не менее, большинство нейронных культур, используемых в исследованиях сегодня, являются смешанными. Исследователи могут проверить и проверяют эффекты лечения половыми стероидами в смешанных культурах нейронов на моделях повреждений и заболеваний нейронов, но накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что женский мозг реагирует на андрогены, эстрогены и прогестерон иначе, чем мужской. Кроме того, новорожденные самцы и самки грызунов по-разному реагируют на ишемическое повреждение, причем самцы испытывают большее повреждение после ишемии головного мозга, чем самки. Таким образом, смешанные половые нейронные культуры могут затемнять и запутывать экспериментальные результаты; Важная информация может быть упущена. По этой причине лаборатория Херсона в Медицинской школе Университета Колорадо регулярно подготавливает стратифицированные по полу первичные диссоциированные эмбриональные нейронные культуры как из гиппокампа, так и из коры головного мозга. Эмбрионы полируются до забора мозговой ткани, а мужская и женская ткани разъединяются отдельно, покрываются отдельно и поддерживаются отдельно. Используя этот метод, лаборатория Херсона продемонстрировала специфичную для мужчин роль ионного канала TRPM2 в ишемической гибели клеток. В этой рукописи мы делимся и обсуждаем наш протокол определения пола эмбриональных мышей и подготовки стратифицированных по полу культур первичных диссоциированных нейронов гиппокампа. Этот метод может быть адаптирован для получения стратифицированных по полу корковых культур, а метод определения пола эмбрионов может быть использован в сочетании с другими протоколами для любого исследования, в котором пол считается важным фактором, определяющим исход.

Введение

Млекопитающие имеют половой диморфизм, причем самцы и самки демонстрируют разные черты и характеристики. Половые различия распространяются даже на мозг и проявляются в восприимчивости нейронов к травмам и заболеваниям (рассмотрено впунктах 1-5). Например, мужской мозг более подвержен ишемическому повреждению нейронов в результате инсульта или остановки сердца с последующей реанимацией (рассмотрено впункте 6). Болезнь Паркинсона (рассмотрено в7) и шизофрения (рассмотрено в8) чаще встречаются у мужчин, чем у женщин, в то время как женский мозг более восприимчив к болезни Альцгеймера (рассмотрено в9) и расстройствам настроения, таким как депрессия (рассмотрено в10). Несмотря на наблюдаемые различия между полами в восприимчивости к повреждениям нейронов и заболеваниям, большинство современных парадигм лечения не учитывают пол и сходны как у мужчин, так и у женщин. Большего успеха можно было бы достичь, если бы половые различия учитывались и понимались.

In vivo животные модели повреждений и болезней нейронов демонстрируют половой диморфизм, сходный с человеческим, и имеют решающее значение для улучшения нашего понимания половых различий и того, как эти различия влияют на выживание и функционирование нейронов. Данные продемонстрировали, например, что самцы грызунов более восприимчивы, чем самки, к ишемическому повреждению нейронов11-15. Считается, что эта разница по крайней мере частично зависит от молекулярной передачи сигналов тестостерона, основного мужского полового стероидного гормона, и эстрогена, основного женского полового стероидного гормона. Исследования на самцах и самках грызунов, подвергшихся гонэктомии, показали, что тестостерон и метаболит тестостерона, дигидротестостерон (ДГТ) усиливают, а эстроген снижает повреждение нейронов после ишемии головного мозга12-14,16-18. Однако половые различия в ишемии головного мозга присутствуют как у новорожденных, так и у взрослых животных19,20. Новорожденные испытывают всплески эстрогена или тестостерона в утробе матери во время развития, но имеют относительно низкий уровень гормона после рождения до полового созревания (рассмотрено в21). Таким образом, наличие или отсутствие первичного полового гормона не является единственным фактором, определяющим восприимчивость нейронов к повреждениям, зависящим от пола. Действительно, вполне вероятно, что половые диморфизмы устанавливаются во время развития, что приводит к различиям в клеточной сигнализации и реакции на ишемию даже при низком уровне гормонов.

Независимо от того, зависят ли половые различия от присутствия полового стероидного гормона или они обусловлены диморфизмами, установленными во время развития, при дальнейшем изучении становится ясно, что существуют различия в клеточной сигнализации между самцами и женщинами в мозге. В лаборатории Херсона в Медицинской школе Университета Колорадо мы выявили одно такое различие. Мы обнаружили, что проницаемый ионный канал кальция, натрия и калия, TRPM2 (рассмотрен в22,23), индуцирует гибель нейрональных клеток после ишемического повреждения in vivo у самца, но не у самки мыши24. Мы демонстрируем, что фармакологическое ингибирование или генетический нокдаун TRPM2 является защитным у самца, но не у самки мыши в нашей модели окклюзии средней сонной артерии (MCAO) инсульта 24 in vivo.

Несмотря на их полезность, in vivo животные модели ишемического повреждения нейронов иногда могут быть ограничены для молекулярных исследований гибели нейронов из-за трудности или невозможности целенаправленно нацеливаться на нейроны для исследования. По этой причине наша лаборатория использует первичные диссоциированные нейроны коры головного мозга или гиппокампа in vitro в дополнение к нашей работе in vivo. Первичные диссоциированные культуры нейронов представляют собой полезный инструмент для исследования клеточных сигнальных путей, участвующих в повреждении и заболевании нейронов. Нейроны в культуре могут поддерживаться в строго контролируемой среде, с глиальным входом или без него. При отсутствии глии любые реакции, наблюдаемые в культуре, являются нейронными. Фармакологические препараты могут быть введены в культуру без опасений по поводу абсорбции через гематоэнцефалический барьер, что позволяет ингибировать или активировать определенные компоненты данного пути передачи сигнала. Молекулярная биология может быть использована для сверхэкспрессии или подавления различных белков, представляющих интерес, а электрофизиологические измерения могут быть проведены на отдельных клетках, что было бы невозможно в модельной системе in vivo.

Лаборатория Херсона расширяет полезность первичных диссоциированных нейронных культур, сначала определяя пол эмбрионов, используемых для приготовления культур. Мужские и женские культура нейронов, стратифицированные по полу, ясно демонстрируют, что мужские нейроны более восприимчивы, чем женские, к гибели нейрональных клеток послекислородного и глюкозного голодания. Кислородное и глюкозное голодание является общепринятой моделью ишемии нейронов in vitro, поскольку ишемия снижает доступность кислорода и глюкозы в мозге. Кроме того, с помощью электрофизиологических экспериментов на диссоциированных, стратифицированных по полу нейронах мы продемонстрировали, что TRPM2 активируется в мужских, но не женских нейронах24,26. В настоящее время мы исследуем молекулярно-специфичные для пола регуляторы активности TRPM224,26. В этой статье мы делимся и обсуждаем наш протокол создания стратифицированных по полу первичных эмбриональных диссоциированных культур нейронов гиппокампа и представляем репрезентативные данные с использованием этого метода, которые свидетельствуют о том, что фермент репарации ДНК, PARP-1, способствует ишемической гибели клеток специфичным для пола образом, аналогичным TRPM2. PARP-1 активируется при разрыве ДНК из-за окислительного стресса (рассмотрено в27,28). Когда повреждение ДНК минимально, активность PARP-1 повышает выживаемость клеток, но когда повреждение чрезмерно, повышенная активность PARP-1 усугубляет гибель клеток. PARP-1 продуцирует поли-(АДФ)рибозу, известный активатор канала TRPM228-31, и некоторые данные свидетельствуют о том, что PARP-1 активируется преимущественно в мужском, а не женском мозге в ответ на окислительный стресс32,33. Таким образом, мы предполагаем, что PARP-1 активирует TRPM2 у самцов, но не у самок, вызывая гибель нейрональных клеток в ответ на кислородное и глюкозное голодание.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры в этом протоколе были проведены в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения по этичному обращению и уходу за животными, а также в соответствии с утвержденным протоколом использования животных IACUC.

1. Приготовление тарелок для культивирования тканей, питательных сред и инструментов для вскрытия должно быть выполнено по крайней мере за один день до диссекции

  1. Приготовьте 1 л боратного буфера: 3,1 г/л борной кислоты и 4,75 г/л буры в двойной дистилляции H2O. Отрегулируйте pH до 8,4. Процедить-стерилизовать и хранить при температуре 4 °C до использования.
  2. Разведите поли-D-лизин до 0,1 мг/мл.
    1. Под колпак для культуры тканей с ламинарным потоком поместите достаточно разбавленного поли-D-лизина, чтобы обильно покрыть дно каждой лунки многолуночной, обработанной культурой, стерильной тарелки для культивирования тканей. (При желании, предварительно очищенные, стерильные стекла могут быть добавлены на дно каждой лунки перед добавлением поли-D-лизина. Покровные стекла могут всплывать после добавления поли-D-лизина, поэтому при необходимости их следует отодвигать стерильными щипцами.)
    2. Инкубируйте планшеты в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 °C.
  3. Приготовьте 1 л буфера для рассечения: 350 мг/л NaHCO3, 2,38 г/л HEPES, 1,44 г/л MgSO4 и 300 мг/л BSA в 1x Hanks Balanced Salt Solution без Ca, Mg, пирувата натрия или фенолового красного. Отрегулируйте pH до 7,3. Процедить-стерилизовать и хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока не понадобится.
  4. Приготовьте 500 мл гальванической среды: 10% фетальная сыворотка крупного рогатого скота, по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, а также 2,5 мМ глутамина в МЕМ без фенола красного. Фильтр-стерилизовать. Хранить при температуре 4 °C до необходимости. Выбросьте все неиспользованные носители через 1 месяц.
  5. Приготовьте 500 мл питательной среды: 2% добавка В-27, по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, и 2,0 мМ ГлутаМАКС (не глутамин) в Нейробазале без фенола красного. Фильтр-стерилизовать. Хранить при температуре 4 °C до необходимости. Выбросьте остатки питательной среды через 1 месяц.
  6. Приготовьте 10 мл 100 мМ CaCl2, 500 мМ ЭДТА и 1 М NaOH по мере необходимости в соответствии со стандартными методами.
  7. Автоклавируйте хирургические/диссекционные инструменты и храните в стерильных условиях до тех пор, пока они не понадобятся. Для этой процедуры требуются два острых щипца с очень тонким наконечником, изогнутые щипцы с тонким наконечником, зубчатый изогнутый щипец, маленькие щипцы с крысиными зубами, одна пара микрохирургических ножниц, одна пара тонких хирургических ножниц с узким концом, одна пара ножниц со средним наконечником и зонд с тупым концом. Дополнительные стерильные инструменты могут быть добавлены в соответствии с личными предпочтениями.

2. Приготовление блюд для культивирования тканей, питательных сред, инструментов для вскрытия и области вскрытия, которые должны быть выполнены в день вскрытия

  1. Промойте планшеты для культуры тканей, покрытые поли-D-лизином. Под ламинарным проточным шкафом биобезопасности отсадите поли-D-лизин с помощью вакуумной линии или пипетки, добавьте воду в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение ~5 минут. Отсадите воду и замените ее чистой, стерильной водой. Повторите 3 раза.
    1. Дайте пластинам полностью высохнуть при комнатной температуре.
  2. Подготовьте место вскрытия, протерев счетчик и зону для вскрытия 70% этанолом.
    1. Пропитайте большую вату Kimwipe 70% этанолом и разложите автоклавные инструменты для препарирования. Накройте еще одним Кимвайпом.
    2. Наполните большую плоскую тарелку льдом. Промаркируйте и заполните соответствующее количество 60 мм посуды для культуры раствором для холодной диссекции. Приготовьте достаточно блюд, чтобы мужская и женская головы, мозг и гиппокамп были отделены друг от друга (если применимо).
    3. Наполните две большие 100-миллиметровые чашки для культур буфером для холодной диссекции.
    4. Отложите отдельную посуду диаметром 100 мм без буфера (сухую).
    5. Создание зоны для биологически опасных отходов и другой зоны для тканей животных (которые должны быть утилизированы надлежащим образом после вскрытия в соответствии с институциональными стандартами).
  3. Нагрейте 30 мл гальванического материала на водяной бане при температуре 37 °C. Этот теплый раствор будет использоваться на этапе диссоциации клеток протокола.
  4. Поместите 1 мл гальванического материала в каждую лунку из 24-луночного тканевого планшета, покрытого поли-D-лизином. Используйте соответствующий меньший объем, если используются пластины меньшего размера. Поместите накрытую пластину в инкубатор при температуре 37 °C при 5%CO2, чтобы согреться и уравновеситься доCO2 во время вскрытия.
  5. Приготовьте раствор папаина.
    1. Пометьте две стерильные конические пробирки объемом 15 мл, одну как «мужскую», а другую как «женскую».
    2. Добавьте в каждую пробирку: 10 мл диссекционного буфера, 150 мкл 100 мМ CaCl2, 10 мкл 500 мМ ЭДТА, 10 мкл 1 М NaOH и 150 ЕД папаина.
    3. Аккуратно перемешайте, трижды перевернув трубку, затем нагрейте на водяной бане при температуре 37 °C. Примечание: Каждый флакон папаина будет иметь разную единицу активности на мг папаина, поэтому объем папаина, добавляемого в раствор, будет отличаться от флакона к флакону. Папапин сначала будет мутным, но раствор очистится, когда папаин полностью растворится.

3. Сбор, определение пола и вскрытие эмбрионов E18

  1. Обезболите беременную самку мыши изофлураном или другой подходящей анестезией. Усыпьте мышь под глубокой анестезией путем обезглавливания или вывиха шейки матки.
  2. Работая быстро, очистите брюшную полость самки с помощью 70% этанола. При желании брюшную полость можно побрить перед распылением этанола, чтобы снизить риск загрязнения. Подтяните кожу живота с помощью щипцов с крысиными зубами. Сделайте большой разрез в области живота ножницами со средним наконечником, разрезая кожу и мышцы живота, обнажая внутренние органы.
  3. Осторожно извлеките эмбрионы, приподнимая каждый маточный рог над брюшной полостью, стараясь по возможности не допустить его контакта с внешними тканями (во избежание заражения). Поместите маточные рожки, содержащие эмбрионы, в чашку с холодным физиологическим раствором для рассечения и переложите в лед.
  4. Осторожно извлеките каждого щенка из маточных рогов и эмбрионального мешка. Детеныши хрупкие, поэтому лучше всего это делать, разрезая ткань матки между каждым эмбрионом, чтобы обнажить эмбриональный мешок, а затем аккуратно разрезая мешочек на поверхности краем маленьких узких ножниц. Затем эмбриональная жидкость и щенок могут быть аккуратно протолкнуты через отверстие без повреждения эмбриона.
    1. Если разрез в эмбриональном мешке недостаточно велик для того, чтобы жидкость и щенок могли легко выйти наружу, то осторожно увеличивайте разрез до тех пор, пока щенок не выскользнет с минимальным усилием.
    2. Не сжимайте мешок слишком сильно, чтобы вытолкнуть эмбрион наружу, так как это тоже может повредить эмбрионы.
  5. Удалите голову у одного эмбриона. Оставьте голову в посуде с рассекающим физраствором на льду. Поместите тело эмбриона на спину на сухую 100 мМ чашку под зондом для вскрытия. Используя изогнутые щипцы со средним концом в одной руке и зубчатые изогнутые щипцы в другой, аккуратно расплющите щенка, опуская задние ноги вниз и брюшные, передние ноги вниз и спинные.
  6. При необходимости удалите хвост ножницами; хвост имеет тенденцию скручиваться над животом и может мешать вскрытию.
  7. Освободите задние ноги и зажмите брюшную полость у корня пуповины, называемого пуповиной. Осторожно поднимите вверх. Отпустите передние ноги и другой рукой и микроножницами сделайте маленькую перевернутую букву «v» в области живота чуть выше пупка с острием «v», указывающей на череп.
  8. Снова замените ножницы на изогнутые щипцы. Переверните щипцы так, чтобы острие было вверх и в сторону от животного. С мягкой силой надавите вниз и дорсально на грудную клетку закрытым закругленным краем изогнутых щипцов, одновременно оттягивая вниз и вентрально другими щипцами, распространяя щенка от вентрального к дорсальному. Это растягивающее движение откроет брюшную полость, обнажив кишечник, печень и другие внутренние органы.
  9. С помощью изогнутых щипцов очень мягко надавите на кишечник и печень краниально, используя повторяющиеся размашистые движения. Это позволит постепенно обнажить почки, мочевой пузырь, а главное, внутренние половые органы.
    1. Детенышей мужского пола можно узнать по наличию поперечнополосатых семенников, расположенных чуть ниже почек с каждой стороны. Яички имеют примерно 1/3-1/2 размера почек и иногда опускаются, чтобы располагаться прямо над мочевым пузырем.
    2. Женщин легче всего определить по отсутствию яичек, но их также можно определить по маленькой матке, которая находится над мочевым пузырем, и фаллопиевым трубам, которые тянутся вверх к почкам. При высокой мощности при вскрытии яичники также могут быть идентифицированы как маленькие темные органы на концах фаллопиевых труб непосредственно под почками, а иногда и под почками с обеих сторон.
  10. Как только пол будет определен, выбросьте тело и поместите голову в соответствующую тарелку (мужскую или женскую). Держите головы на льду в растворе для вскрытия.
  11. Повторяйте шаги 3.5-3.10 до тех пор, пока не будет определен пол каждого щенка. Для достижения наилучших результатов протирайте тарелку салфеткой Kimwipe между каждым рассечением; Жидкость делает щенков скользкими и трудными для вскрытия.
  12. После того, как все эмбрионы были разделены по полу и мужские и женские головы были разделены, приступайте к остальной части вскрытия, уделяя особое внимание тому, чтобы все мужские и женские ткани были разделены.
  13. Переносите по одному мозгу за раз в чашку емкостью 100 мМ, наполненную буфером для холодной диссекции. Под эндоскопом для вскрытия с помощью изогнутых щипцов прокалывайте глаза эмбриона, чтобы закрепить его для вскрытия. С помощью микрохирургических ножниц сделайте неглубокий разрез по средней линии, разделяя кожу и череп по средней линии, от основания черепа до макушки головы прямо над носовым проходом.
  14. Аккуратно отодвиньте кожу и череп с обеих сторон и очень осторожно извлеките мозг, осторожно зачерпывая его от переднего мозга к стволу мозга с помощью основания микрохирургических ножниц или с помощью закрытых угловых щипцов.
    1. Осторожно с помощью щипцов перенесите извлеченный мозг в чистую посуду с этикеткой, наполненную буфером для холодной диссекции. Держите блюдо на льду.
    2. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все мозги не будут собраны.
    3. На этом этапе должны быть получены две пластины цельного мозга в буфере для вскрытия, одна для мужской и одна для женской ткани.
  15. Поставьте чистую тарелку под область для вскрытия и заполните буфером для вскрытия. Налейте ровно столько раствора, чтобы мозги оставались влажными на протяжении всего рассечения гиппокампа; Слишком большое количество приведет к тому, что мозг будет плавать, что затруднит управление. При желании предварительно смажьте дискретальную чашку стерильным воском. Воск обеспечивает нескользящую поверхность для работы и защищает кончики тонких инструментов для препарирования; Царапание дна посуды без покрытия может погнуть или затупить острые края инструментов.
  16. Измените область рассечения на высокую мощность и соответствующим образом отрегулируйте фокус. Осторожно переносите по одному мозгу за раз в тарелку для вскрытия. С помощью щипцов с очень тонкими наконечниками раздвиньте каждое полушарие мозга и отщипните их от ствола мозга.
  17. Очень осторожно удалите мозговые оболочки с каждого полушария. (Мозговые оболочки представляют собой розоватую оболочку, богатую кровеносными сосудами, и являются распространенным источником глиального загрязнения в культуре нейронов.)
    1. Чтобы удалить мозговые оболочки, осторожно сожмите, приподнимите и потяните за мембрану, стараясь не проколоть ткань мозга под ней.
    2. Оттяните мозговые оболочки от мозга, позволяя мозгу немного скатиться под щипцами, но удерживая его на месте, чтобы мембрана могла быть оттянута.
  18. На этом этапе вы можете дополнительно препарировать мозг, чтобы использовать выбранную ткань. Например, рассеките гиппокамп из каждого полушария. Положите одну полусферу боковой стороной вниз. Понаблюдайте за большой полостью желудочка, которая создает лоскут, покрывающий гиппокамп. Аккуратно откиньте этот лоскут назад, пока не будет виден гиппокамп в форме полумесяца. Гиппокамп немного приподнят и находится между средним мозгом и корой головного мозга.
  19. Используя две пары острых, очень тонких щипцов, держите полушарие мозга открытой одной рукой, а другой разрежьте гиппокамп от коры и среднего мозга.
    1. Поместите гиппокамп в правильно маркированную посуду (мужскую или женскую), наполненную буфером для вскрытия и держащую на льду.
    2. Рассеките гиппокамп от остального полушария и повторите этот процесс с каждым мозгом.
  20. Переложите гиппокампы в конические пробирки объемом 15 мл с соответствующей маркировкой.
    1. Аккуратно промойте дважды с помощью буфера для холодной диссекции. На этом этапе используйте вакуумное отсасывание очень осторожно. Гиппокампы малы и могут быть безвозвратно потеряны в вакууме. Предотвратите это, позволив ткани осесть на дно пробирки, удалите как можно больше жидкости из пробирки с помощью пипетки, выбросьте раствор и замените его свежим, чистым буфером для рассечения.
    2. Повторите шаг 3.20.1.

4. Диссоциация нейронов

  1. Переложите гиппокамп в соответствующим образом маркированный, предварительно подогретый раствор папаина. Поместите на водяную баню при температуре 37 °C и выдерживайте 8-10 минут, осторожно переворачивая трубки для перемешивания каждые 2-3 минуты.
  2. Удалите папаинскую смесь и салфетку с водяной бани. Дайте ткани осесть, а затем осторожно удалите как можно больше раствора папаина с помощью пипетки, оставив ткань на дне трубки. Промойте салфетку 3 раза с гальваническим материалом. Сыворотка в гальванических средах гасит ферментативное переваривание папаина. Ингибитор трипсина нужен, если сыворотка не используется в гальванических средах.
  3. Снимите гальванический материал.
    1. Добавьте 2 мл свежей нейробазальной среды и аккуратно диссоциируйте ткань с помощью серологической пипетки объемом 5 мл на самой медленной скорости.
    2. Диссоциация выполняется путем аккуратного пипетирования вверх и вниз 8 раз. Будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьки в раствор. Для достижения наилучших результатов соберите раствор и салфетку в пипетке, а затем выпустите раствор на боковую сторону конической трубки, позволяя ткани скользить вниз по боковой стороне и обратно на дно трубки.
  4. После 8-го растирания дайте ткани осесть и соберите сверху мутные среды. Эта среда содержит диссоциированные клетки.
    1. Переложите его в новую пробирку с маркировкой.
    2. Добавьте еще 2 мл в неразряженную ткань.
    3. Растираем еще раз в 8 раз.
    4. Соберите урожай с мутной среды.
    5. Повторите этот процесс 3-5 раз. Останется некоторое количество недиссоциированной ткани. Несмотря на то, что можно растирать до тех пор, пока вся ткань не будет диссоциирована, чрезмерное растирание приводит к ухудшению здоровья нейронов и не рекомендуется.
  5. При необходимости добавляйте дополнительную среду в конические трубки, чтобы выровнять объемы и вес между мужскими и женскими тканями. Центрифугируйте клетки в центрифуге с вращающимся ведром при давлении 228 x g в течение 5 минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость.
  6. Аккуратно суспендируйте клетки в 2 мл свежей гальванической среды и отфильтруйте раствор через сетчатое сетчатое сетчатое ситечко в чистую коническую пробирку объемом 50 мл с маркировкой.
  7. Добавьте 50 мкл клеточной суспензии к 450 мкл 0,4% трипанового синего. Инкубируйте клетки в течение 2 минут в Trypan Blue, аккуратно перемешайте и загрузите 10 μл на гемоцитометр. Посчитайте клетки, исключив те, которые впитали краситель Трипановый синий; Темно-синие клетки мертвы или умирают.

5. Покрытие и уход за культурой

  1. Рассчитайте правильный объем клеточной суспензии для добавления в каждую лунку планшета для культуры тканей для получения желаемой плотности клеток. Культуры нейронов очень чувствительны к плотности клеток и лучше всего себя чувствуют при средней и высокой плотности, если их не кокультивировать с глией или не кормить глиальными кондиционированными средами. В этом протоколе клетки покрываются с температурой 150 000-200 000 клеток/см2.
  2. Извлеките из инкубатора планшет для культивирования тканей, предварительно заполненный гальваническим материалом (подготовленный на шаге 2 выше).
    1. Аккуратно взболтайте клеточную суспензию в конической пробирке объемом 50 мл, затем нанесите пипеткой желаемый объем клеточной суспензии (рассчитанный выше в шаге 5.1) в центр каждой лунки.
    2. Повторяйте, взбивая клеточную суспензию каждый раз перед пипетированием, чтобы обеспечить одинаковую плотность клеток в каждой лунке. Клетки быстро оседают, и плотность клеток может меняться от скважины к скважине, если пропустить этап завихрения.
  3. После того, как ячейки были добавлены в каждую лунку, аккуратно покрутите пластину, чтобы разогнать клетки, а затем немедленно установите чашку на место в инкубаторе. Оставьте клетки в покое не менее чем на 24 часа.
  4. Не менее чем через 24 часа после нанесения покрытия на клетки нагрейте полную нейробазальную питательную среду до 37 °C. Отсасывайте гальваническую среду из каждой лунки и замените ее питательной средой. Отсаживайте и заменяйте из одной лунки за раз, чтобы свести к минимуму нейронный стресс и улучшить выживаемость клеток.
  5. Культуры нейронов следует подкармливать каждые 4-7 дней, осторожно удаляя половину среды и добавляя обратно равный объем свежей среды. В этих условиях культуры можно выдерживать в течение двух недель. При использовании первичных культур нейронов ожидается некоторая гибель клеток. Таким образом, по мере созревания культур плотность будет снижаться. В этом протоколе плотность клеток снижается примерно на 30% к 10-му дню in vitro.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Правильное определение пола эмбрионов мышей является критическим этапом при подготовке первичных культур нейронов с разделением по полу. Чтобы гарантировать, что гиппокампы самцов и самок культивировались отдельно из правильно определенных по полу плодов, эмбрионы разделяли по полу, после чего извлекали кору и гиппокамп. Геномную ДНК выделяли из полученных тканей каждого эмбриона согласно стандартным процедурам, строго соблюдая разделение по полу. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием праймеров к с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Стратифицированные по полу первичные диссоциированные культуры нейронов гиппокампа, в которых мужские и женские гиппокампы расчленены, диссоциированы и культивируются отдельно, представляют собой полезный инструмент для изучения сигнализации клеток, специфичных для пола, при гибели нейронных клеток. В то время как нейробиологи обычно используют первичные нейронные культуры, протоколы различаются в разных лабораториях в зависимости от их конкретных экспериментальных целей и интересов. Многие исследователи предпочитают кок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа частично поддерживается Фондом Уолтера С. и Люсьены Дрискилл и NIH R01NS058792.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
B27 ДобавкаInvitrogen17504-044
БураSigma71997
Борная кислотаSigmaB6768
Бычья сыворотка АльбуминSigmaA4503
Фетальная бычья сывороткаInvitrogen26140-079
GlutaMAXInvitrogen35050-061
ГлютаминInvitrogen25030-081
HBSS, без кальция, без магния, без фенолакрасный Invitrogen14175-095
MEM, без глютамина, без фенола красныйInvitrogen51200-038
Нейробазал, без глютамина, без фенола красныйInvitrogen12348-017
Пенициллин/стрептомицинInvitrogen15070-063
Поли-D-лизин, MW 70 000-150 000SigmaP0899
Трипановый синий 0,4%Invitrogen15250-061
ОБОРУДОВАНИЕ
Dumont #5/45 Угловые щипцыFine Science Tools11251-35
Dumont #7 – Тонкие изогнутые щипцыFine Science Tools11274-20
Зубчатые (Лондон) ЩипцыFine Science Tools11080-02
Extra Fine Graefe Щипцы 1 x 2 зубаFine Science Tools11153-10
Moria Spring ScissorsFine Science Tools15396-00
Среднеоперационные ножницыRoboz SurgicalRS-6812
Сверхтонкие микропрепарирующие ножницыRoboz SurgicalRS-5880
24-луночные планшеты для культивирования тканейFisher87721
Клеточный фильтр, 40 &; Нейлоновая сетка MBD Biosciences352340

Ссылки

  1. Andreano, J. M., Cahill, L. Sex influences on the neurobiology of learning and memory. Learn Mem. 16, 248-266 (2009).
  2. Arnold, A. P., Burgoyne, P. S. Are XX and XY brain cells intrinsically different. Trends Endocrinol. Metab. 15, 6-11 (2004).
  3. Cahill, L. Why sex matters for neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 7, 477-484 (2006).
  4. Jazin, E., Cahill, L. Sex differences in molecular neuroscience: from fruit flies to humans. Nat. Rev. Neurosci. 11, 9-17 (2010).
  5. Morris, J. A., Jordan, C. L., Breedlove, S. M. Sexual differentiation of the vertebrate nervous system. Nat. Neurosci. 7, 1034-1039 (2004).
  6. Lang, J. T., McCullough, L. D. Pathways to ischemic neuronal cell death: are sex differences relevant. J. Transl. Med. 6, 33(2008).
  7. Van Den Eeden, S. K., et al. Incidence of Parkinson's disease: variation by age, gender, and race/ethnicity. Am. J. Epidemiol. 157, 1015-1022 (2003).
  8. Abel, K. M., Drake, R., Goldstein, J. M. Sex differences in schizophrenia. Int. Rev. Psychiatry. 22, 417-428 (2010).
  9. Vest, R. S., Pike, C. J. Gender, sex steroid hormones, and Alzheimer's disease. Horm. Behav. 63, 301-307 (2013).
  10. Fernandez-Guasti, A., Fiedler, J. L., Herrera, L., Handa, R. J. Sex, stress, and mood disorders: at the intersection of adrenal and gonadal hormones. Horm. Metab. Res. 44, 607-618 (2012).
  11. Hall, E. D., Pazara, K. E., Linseman, K. L. Sex differences in postischemic neuronal necrosis in gerbils. J. Cereb. Blood Flow Metab. 11, 292-298 (1991).
  12. Hawk, T., Zhang, Y. Q., Rajakumar, G., Day, A. L., Simpkins, J. W. Testosterone increases and estradiol decreases middle cerebral artery occlusion lesion size in male rats. Brain Res. 796, 296-298 (1998).
  13. Nakano, T., Hurn, P. D., Herson, P. S., Traystman, R. J. Testosterone exacerbates neuronal damage following cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in mouse. Brain Res. 1357, 124-130 (2010).
  14. Pan, Y., et al. Effect of testosterone on functional recovery in a castrate male rat stroke model. Brain Res. 1043, 195-204 (2005).
  15. Siegel, C., Turtzo, C., McCullough, L. D. Sex differences in cerebral ischemia: possible molecular mechanisms. J. Neurosci. Res. 88, 2765-2774 (2010).
  16. Uchida, M., et al. Dose-dependent effects of androgens on outcome after focal cerebral ischemia in adult male mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1454-1462 (2009).
  17. Yang, S. H., et al. Testosterone increases neurotoxicity of glutamate in vitro and ischemia-reperfusion injury in an animal model. J. Appl. Physiol. 92, 195-201 (2002).
  18. Cheng, J., Alkayed, N. J., Hurn, P. D. Deleterious effects of dihydrotestosterone on cerebral ischemic injury. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1553-1562 (2007).
  19. Nunez, J. Sex and steroid hormones in early brain injury. Rev. Endocr. Metab. Disord. 13, 173-186 (2012).
  20. Renolleau, S., Fau, S., Charriaut-Marlangue, C. Gender-related differences in apoptotic pathways after neonatal cerebral ischemia. Neuroscientist. 14, 46-52 (2008).
  21. McCarthy, M. M., Konkle, A. T. When is a sex difference not a sex difference. Front Neuroendocrinol. 26, 85-102 (2005).
  22. Aarts, M. M., Tymianski, M. TRPMs and neuronal cell death. Pflugers Arch. 451, 243-249 (2005).
  23. Jiang, L. -H., Yang, W., Zou, J., Beech, D. J. TRPM2 channel properties, functions and therapeutic potentials. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 973-988 (2010).
  24. Jia, J., et al. Sex differences in neuroprotection provided by inhibition of TRPM2 channels following experimental stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2160-2168 (2011).
  25. Fairbanks, S. L., et al. Mechanism of the sex difference in neuronal ischemic cell death. Neuroscience. 219, 183-191 (2012).
  26. Verma, S., et al. TRPM2 channel activation following in vitro ischemia contributes to male hippocampal cell death. Neurosci. Lett. 530, 41-46 (2012).
  27. Bai, P., Canto, C. The role of PARP-1 and PARP-2 enzymes in metabolic regulation and disease. Cell Metab. 16, 290-295 (2012).
  28. Blenn, C., Wyrsch, P., Bader, J., Bollhalder, M., Althaus, F. R. Poly(ADP-ribose)glycohydrolase is an upstream regulator of Ca2+ fluxes in oxidative cell death. Cell Mol. Life Sci. 68, 1455-1466 (2011).
  29. Buelow, B., Song, Y., Scharenberg, A. M. The Poly(ADP-ribose) polymerase PARP-1 is required for oxidative stress-induced TRPM2 activation in lymphocytes. J. Biol. Chem. 283, 24571-24583 (2008).
  30. Fonfria, E., et al. TRPM2 channel opening in response to oxidative stress is dependent on activation of poly(ADP-ribose) polymerase. Br. J. Pharmacol. 143, 186-192 (2004).
  31. Miller, B. A. Inhibition of TRPM2 function by PARP inhibitors protects cells from oxidative stress-induced death. Br. J. Pharmacol. 143, 515-516 (2004).
  32. Vagnerova, K., et al. Poly (ADP-ribose) polymerase-1 initiated neuronal cell death pathway--do androgens matter. Neuroscience. , 166-476 (2010).
  33. Yuan, M., et al. Sex differences in the response to activation of the poly (ADP-ribose) polymerase pathway after experimental stroke. Exp. Neurol. 217, 210-218 (2009).
  34. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2496-2500 (1986).
  35. Dumesic, D. A., Renk, M., Kamel, F. Estrogenic effects of phenol red on rat pituitary cell responsiveness to gonadotropin-releasing hormone. Life Sci. 44, 397-406 (1989).
  36. Ernst, M., Schmid, C., Froesch, E. R. Phenol red mimics biological actions of estradiol: enhancement of osteoblast proliferation in vitro and of type I collagen gene expression in bone and uterus of rats in vivo. J. Steroid Biochem. 33, 907-914 (1989).
  37. Hubert, J. F., Vincent, A., Labrie, F. Estrogenic activity of phenol red in rat anterior pituitary cells in culture. Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 885-891 (1986).
  38. Ortmann, O., Sturm, R., Knuppen, R., Emons, G. Weak estrogenic activity of phenol red in the pituitary gonadotroph: re-evaluation of estrogen and antiestrogen effects. J. Steroid Biochem. 35, 17-22 (1990).
  39. Rajendran, K. G., Lopez, T., Parikh, I. Estrogenic effect of phenol red in MCF-7 cells is achieved through activation of estrogen receptor by interacting with a site distinct from the steroid binding site. Biochem. Biophys. Res. Commun. 142, 724-731 (1987).
  40. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell Endocrinol. 57, 169-178 (1988).
  41. Moreno-Cuevas, J. E., Sirbasku, D. A. Estrogen mitogenic action. III. is phenol red a "red herring"? In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 447-464 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Определение пола эмбрионов мышиизоляция нейронов гиппокампакислородно-глюкозная депривацияингибирование каналов TRPM2мыши с нокаутом PARP1покрытие поли-D-лизиномприготовление нейробазальной средыпосев клеток с заданной плотностьювестерн-блот анализ
Секс Стратифицированная нейронов культур для изучения ишемических: Подготовка гибель клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.