Studieren Wechselwirkungen von<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

Zusammenfassung

Wir präsentieren Methoden, um die Wirkung von PSM und andere Giftstoffe ausgeschieden durch studieren Staphylococcus aureus Auf Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie.

Zusammenfassung

Wir präsentieren Methoden, um die Wirkung von Phenol löslich modulins (PSM) und andere Toxine und Staphylococcus aureus auf Neutrophilen sezerniert studieren. Um die Auswirkungen der PSM auf Neutrophilen wir isolieren frisch Neutrophilen mittels Dichtegradientenzentrifugation studieren. Diese Neutrophilen werden mit einem Farbstoff, der auf Calcium-Mobilisierung fluoresziert geladen. Die Aktivierung von Neutrophilen durch PSMs initiiert eine rasche und vorübergehende Erhöhung der freien intrazellulären Calcium-Konzentration. In einem Experiment Durchflusszytometrie diese rasche Mobilisation kann durch Überwachung der Fluoreszenz eines vorinstallierten Farbstoff, der auf die erhöhte Konzentration an freiem Ca ^{2 +} reagiert gemessen werden. Mit dieser Methode können wir bestimmen, die PSM-Konzentration notwendig, um die Neutrophilen zu aktivieren, und messen die Auswirkungen von spezifischen und allgemeinen Inhibitoren der Aktivierung von Neutrophilen.

Um die Expression der PSMs in den intrazellulären Raum, w untersuchene konstruiert haben Reporter Fusionen der Promotor des PSMα Operon zu GFP. Wenn diese Reporter Stämme von S. aureus durch Neutrophile phagozytiert werden, kann die Induktion der Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.

Einleitung

Neutrophile (PMN) sind professionelle Fresszellen, die eine wichtige Rolle spielen bei der angeborenen Immunantwort gegen Staphylococcus aureus ^1. Der ständige Kampf zwischen Wirt und Mikrobe hat zu einem Wettrüsten der beiden führte. Kürzlich, community-associated (CA) Stämme von Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) sind entstanden, die zu sein scheinen sehr effizient in Umgehung der neutrophilen Tötung ^2,3. Übermäßige Phenol löslich modulin (PSMs) Produktion von CA-MRSA hat mit höherer Virulenz ^4,5 in Verbindung gebracht. Humanneutrophilen können diese PSMs über FPR2 die Aktivierung dieses G-Protein-gekoppelten....

Protokoll

1. Isolation von PMN aus menschlichem Blut durch Dichtezentrifugation

1. Unentschieden 5 9 ml Röhrchen heparinisierter venösen Blut.
2. Bereiten Dual-Layer-Ficoll-Gradienten (4 Steigungen für 5 Gefäße Blut) wie folgt: Gießen Sie 12 ml mit einer Dichte von 1,119 g / ml Ficoll-Lösung in einem 50 ml-Tube und sorgfältig Schicht 10 ml mit einer Dichte von 1,077 g / ml Ficoll-Lösung an der Spitze.
3. Man verdünnt das Blut mit einem gleichen Volumen von PBS.
4. Schicht das verdünnte Blut vorsichtig auf die Dual-Layer-Ficollgradienten; 20-25 ml pro Gradienten.
5. Zentrifuge 20 min bei 396 xg in einem Ausschwingrotor, 22 ° C ohne Bremsen. <....

Ergebnisse

Durchflusszytometrische Assay zur Beurteilung der Mobilisierung von Kalzium im menschlichen PMNs

Inkubieren Neutrophilen mit einer Konzentration Reihe synthetischer PSMα3 wodurch eine schnelle Aktivierung durch Calcium-Fluss, der durch eine Erhöhung des Signals im FL-1 gezeigt, wird gemessen. Pre-Inkubation von synthetischen PSMα3 mit 0,01%, 0,1% oder 1% humanem Serum erheblich behindert die Fähigkeit, Kalzium Flüsse (Abbildung 1) zu entlocken.

Analyse.......

Diskussion

In der hier beschriebenen Verfahren einige Schritte sind sehr kritisch. Wir werden diese hier hervorzuheben.

Für die Isolierung von Neutrophilen durch Dichtegradientenzentrifugation ist es wichtig, die Schichten während oder nach der Zentrifugationsschritte stören. Wenn Ansaugen der Neutrophilen mit einem Kunststoff-Pipette, stellen Sie sicher nicht, um den Ballon zu quetschen, während in der Schicht von Zellen, wie Ausstoßen von Flüssigkeit werden die Schichten zu stören. Auch eine Sichtkon.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fluo-3, AM	Molekulare Sonden / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	Dichte 1,077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	Dichte 1,119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	enthält 25 mM HEPES und L-Glutamin
Leica TCS SP5 Mikroskop	Leica Microsystems, Niederlande	TCS SP5	Objektiv: HCX PL APO 40x/0,85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Sehr wichtig, dass das Rohr während des Messvorgangs entfernt und ausgetauscht werden kann