Конфокальной микроскопии одиноких митохондриальных супероксид вспышек в интактных Сердце или В Vivo

Summary

Конфокальной сканирующей микроскопии применяется для работы с изображениями одиночных митохондриальные события в перфузии сердца или скелетных мышц в живого животного. Мониторинг в реальном времени отдельных митохондриальных процессов, таких как супероксид вспышек и мембранных возможных колебаний позволяет оценку функции митохондрий в физиологически соответствующем контексте и при патологических возмущений.

Abstract

Митохондрия является одним из важнейших внутриклеточных органелл отвечает за производство энергии и внутриклеточной сигнализации в эукариотических системах. Митохондриальная дисфункция часто сопровождает и способствует болезни человека. Большинство из подходов, которые были разработаны для оценки функции митохондрий и дисфункции основаны на в пробирке или бывших естественных условиях измерений. Результаты этих экспериментов имеют ограниченные возможности в определении функции митохондрий в естественных условиях. Здесь мы описываем новый подход, который использует конфокальной сканирующей микроскопии для визуализации здоровых тканей в живых Aminals, что позволяет оценить одной функции митохондрий в режиме реального времени образом в естественных условиях. Во-первых, мы создаем трансгенных мышей, экспрессирующих митохондриальную целевой показатель супероксид, циркулярно переставленную желтый флуоресцентный белок (т-cpYFP). Наркозом т-cpYFP мыши фиксируется на заказ адаптера стадии и покадровой изображения взяты ером открытые скелетные мышцы задних конечностей. Мышь впоследствии пожертвовал и сердце настроен на Лангендорфа перфузии с физиологическими решений при 37 ° С Перфузии сердца позиционируется в специальной камере на конфокальной столик микроскопа и нежный давление применяется для иммобилизации сердце и подавлять сердцебиение индуцированной артефакт движения. Супероксидного вспышки обнаруживаются в реальном времени 2D конфокальной микроскопии на частоте одного кадра в секунду. Решение перфузии можно модифицировать, чтобы содержать различные субстраты дыхания или других флуоресцентных индикаторов. Перфузии также может быть скорректирована, чтобы произвести модели заболеваний, таких как ишемии и реперфузии. Эта техника является уникальный подход для определения функции одной митохондрии в здоровых тканей и в естественных условиях.

Introduction

Митохондрии играют центральную роль в клеточных биоэнергетики, бесплатный сигнализации радикал, окислительно-восстановительного гомеостаза, регулирование ионного и клеточных судеб определения ^1,2. Митохондрии дисфункция часто сопровождает и лежит в основе патогенеза заболеваний ^3-6. Особенно в системах мышц, таких как сердце и скелетных мышц, дыхание митохондрий обеспечивает большую часть АТФ, чтобы поддержать своевременное регулирование внутриклеточного кальция и надежный ^7,8 развития силы. Эти мышцы обладают большое количество митохондрий, которые часто занимают до 20-40% от общего объема клеток и "фиксированных" между миофиламентов....

Protocol

1. Эксперимент Подготовка

1. Подготовьте изотонический сбалансированный солевой раствор (50 мл), содержащий: 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl _2, 2 мМ MgCl ₂ и 10 мМ HEPES (рН 7,2) для скелетных мышц визуализации в естественных условиях.
2. Подготовить 1 л Кребса-Хенселейта буфера (КАХАБ), содержащий: 118 мм NaCl, 5,3 мМ KCl, 1,2 мм MgSO _4, 0,5 мМ ЭДТА и 25 мМ NaHCO _3.
3. Пузырь KHB с газом, содержащим 95% O _2/5% CO ₂ в течение 10-15 мин перед добавлением 2 мМ CaCl _2. Добавить метаболические субстраты (например, 10 мМ глюкозы и 0,5 мМ пирувата).
....

Results

В соответствии с этим протоколом, в естественных изображений отдельных митохондриальных событий может быть сделано в скелетных мышцах анестезированных мышей после чего на месте изображений в перфузии сердца (рис. 1). Оптимальная настройка условий обработки изображений обеспечит четкие изображения здоровых тканей мышц и с одной резолюции митохондрий (рис. 2). TMRM часто используется для проверки расположение MT-cpYFP и должны показать полную перекрытия модель с сигналом.......

Discussion

Визуализация одиночных митохондриальные события в живого животного или перфузированных органов имеет существенное преимущество по сравнению с традиционными методами митохондриальной ^{17,19,21,22,24,25} оценки функции. Техника, описанная здесь можно добиться реального времени в определении месте митохондриальной функции в реальной физиологического состояния на субклеточном резолюции. Это особенно полезно в сочетании с другими измерениями, чтобы системно изучить роль митохондрий в нормальной фун.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Конфокальный линейный сканирующий микроскоп (LSM 510 Meta, Zeiss), версия программного обеспечения 4.2 SP1, включая модуль "Физиологический анализ".