우리는 급속한 항생제 감수성 시험을 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건을 살아남을 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 스트레스 기반 환경에서 항생제 감수성 검사를 위한 신속한 미세 유체 방법을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건에서 살아남습니다. 이 방법의 뒤에 가설은 새로운: 항생제의 표적인 생화확적인 통로의 스트레스 활성화는, 항생제 감수성 시험을 가속화할 수 있습니다. 표준 항생제 감수성 검사 방법에 비해, 속도 제한 단계 - 세균 성장 - 항생제 적용 중에 생략된다. 이 방법의 기술적 구현은 표준 기술과 혁신적인 접근 방식의 조합입니다. 이 방법의 표준 부분에는 세균 배양 프로토콜, 폴리디메틸실록산(PDMS)의 미세 유체 채널 정의, 형광을 이용한 세포 생존 가능성 모니터링, 박테리아 계수에 대한 배치 이미지 처리 등이 포함됩니다. 이 방법의 혁신적인 부분은 기계적 응력 적용을 위한 배양 매체 흐름의 사용, 박테리아를 손상시키지 만 손상시키지 않는 효소의 사용, 세균 부착을 위한 미세어기 기판의 사용에 있다. 개발 된 플랫폼은 항생제 및 비 항생제 관련 약물 개발 및 테스트에 사용할 수 있습니다. 표준 세균현절 실험과 비교하여, 약물의 효과는 조절 기간 동안 반복적으로 켜고 끌 수 있다. 동일한 세균 집단의 반복적인 관찰은 동일한 실험의 과정을 통해 가능하다.
서론
세균성 저항의 상승은 최후의 수단의 우리의 약을 보호하기 위하여 빠른 표현형 기지를 둔 항생제 감수성 시험에 대한 필요를 강화합니다. 표준 감수성 검사는 여러 (8-24) 시간이 걸리는 항생제의 존재에서 세균 성장 억제에 기초한다. 우리는 항생제의 작용을 가속화하기 위하여 생합성 통로의 긴장 활성화에 의존하는 미세유체 플랫폼에 새로운 항생제 감수성 시험을 개발했습니다.
미세 유체 척도에서 항생제 감수성 검사는 박테리아의 작은 숫자를 필요로하기 때문에 효과적인 샘플 사용의 이점을 수행합니다. 또한, 미세 유체 장치는 다중 조건1,2에서여러 샘플을 테스트하기 위해 멀티플렉스될 수 있다. 최근에는 항생제 감수성 검사를 위한 다수의 미세유체 방법이3-9로보고되고 있다. 이러한 방법에서, 박테리아는 나노 및 피콜리터 물방울3,7,미세 유체 채널4-6,8의전체 부피에서, 또는 채널9의바닥 표면에 전기적으로 국한된 단일 박테리아로서 재배된다. 이 시험은 미세 유체 채널에서 수행되지만, 그들은 모두 기존의 방법과 유사한 항생제의 존재와 부재에서 미생물 성장을 모니터링합니다. 성장 측정은 광학 밀도, pH 민감한 염료 또는 밝은 필드/위상 대비 또는 형광 이미지....
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프로토콜
1. PDMS 레이어 만들기(그림 1)
- 10:1 비율로 PDMS 및 경화제를 적극적으로 혼합합니다. 거품을 제거하려면 실온에서 1 시간 동안 진공 챔버에서 점성 혼합물을 탈가스합니다.
- 스케일로 알루미늄 금형 위에 PDMS를 천천히 붓습니다. 중앙에서 붓고 금형을 수평상태로 유지합니다. 핀을 지키지 않도록 하십시오. 목표 중량이 달성되면 붓는 것을 중지합니다.
우리의 금형에는 PDMS 4 g과 경화 시약 0.4 g가 필요합니다. - 오븐 내부의 금형을 평평하게 하고 밤새 37°C에서 치료합니다.
대체 경화 시간은 60°C에서 2시간 또는 90°C에서 1시간입니다. - 경화 된 PDMS 층을 금형 가장자리를 따라 해부하고 조심스럽게 집게 한 쌍으로 금형 표면에서 벗겨냅니다. 70% 에탄올과 Q-tip으로 금형 표면을 청소합니다.
2. 그림 2에 따라 흐름 셀을 조립합니다.
유리 슬라이드를 갖춘 PDMS의 표준 조립은 두 표면의 산소 플라즈마 처리를 통해 수행되며 PDMS와 현미경 유리 슬라이드 사이의 누출없는 결합을 보장합니다. 제시된 프로토콜에서, 플라즈마 처리는 유리 슬....
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결과
도 4에 제시된 데이터는 항생제 함유 미세 유체 채널에서 시간이 지남에 따라 취약한 황색포도상구균 균주의 반응을 보여줍니다. 1분에서 획득한 위상 대비 이미지는 1시간 실험의 끝에 그림 4A 및 B로 나타낸다. 분석된 1시간 데이터는 적색(5,828)으로 강조표시된 박테리아와 함께 도 4C로 도시된다. 해당 형광 이미지는 그림 4D 및 E로표시됩니다. 분석된 1시간 데이터는 적색(174명 사망)으로 강조된 형광균을 가진 도 4F로 도시된다.
이 이미지 집합은 여러 점을 보여 줍니다. 가장 중요한 것은, 형광균의 수가 크게 증가하여 실험이 끝날 때까지 관찰된다(그림 4D 및 E에서
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토론
제시된 프로토콜은 메티실린에 민감하고 메티실린 내성 황색포도상구균 10균을가진 실험 세트에서 검증되고 최적화되었다. 따라서 수정없이이 프로토콜은 세균성 세포 벽 생합성에 영향을 미치는 작용 메커니즘을 가진 S. 아우레우스 및 기타 항생제의 다른 균주에 직접 적용해야합니다. S. 아우레우스 이외의 박테리아 유형은 스트레스 매개 변수의 변이를 요구할 수 있습니다: 수용성 (효소) 및 기계적 스트레스. 용해성 스트레스제가 포도상 구균 이외의 세균 종의 시험에서 원하는 경우 리소스타핀은 포도상구균이기때문에 다른 스트레스 에이전트가 필요합니다 - 특정 효소.
전단 응력의 양은 액체의 유량에 비례하며 채널의 크기에 반비례하므로 원칙적으로 는 값의 넓은 범위 내에서 다양할 수 있습니다. 응력의 달성된 값은 다음과 같은 실험적 요인에 의해 제한됩니다: 더 높은 유량 하에서 박테리아를 제자리에 고.......
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공개 사항
미세 유체 방법은 특허 출원 중입니다: 사우어-버지 A, 샤론 A, 칼라쉬니코프 M, Wirz H, 발명가; 세균성 항생제 내성/감수성 특허 PCT/US10/33523의 신속한 검출을 위한 방법 및 장치.
감사의 글
우리는 제조 혁신을위한 Fraunhofer 센터의 엔지니어와 학생들에게 감사드립니다. 실험 시스템의 설계, 가공 및 자동화를 돕기 위해 안드레아스 프린젠, 홀거 워스, 더그 포스, 데이비드 차긴, 수동 슈 박사에게 감사드립니다. 줄리아 쿠카르츠, 멜라니 짐머만, 니코 크라에츠마르, 팀 검벨, 조쉬 비야누에바, 미노리 시미즈, 카타르지나 쿨리가 실험 프로토콜 및 데이터 수집 테스트에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 셀 프로파일러의 이미지 분석 루틴의 개발에 도움을 하버드와 MIT의 넓은 연구소에서 이미징 플랫폼의 박사 앤 E. 목수와 마크 앤서니 브레이 박사를 인정합니다. 설명된 이 프로젝트는 국립 알레르기 및 감염증 연구소의 R21AI079474 및 1R01AI101446에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 알레르기 및 전염병 연구소 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 이 프로젝트는 또한 프라운호퍼 미국에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | 데드 셀 형광 염색 |
| 소 세럼 알부민 (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | 리소스타핀 저장에 사용 |
| 아세테이 | 나트륨 Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | 리소스타핀 저장에 사용 |
| 리소스타핀 | Cell Sciences | CRL309A | 1 mg 고형분으로 제공됩니다. 보관: 20mM 아세트산 나트륨에 녹입니다. BSA 용액과 혼합하여 1% BSA 및 100 &마이크로의 최종 농도를 얻습니다. g/ml 보관용 리소스타핀 |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | 항생제 |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| 염화나트륨 | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% 첨가 Mueller-Hilton 육수에 1 |
| ml, Luer-lock 주사기 | BD (벡턴, 디킨슨, 컴프) | 14-823-2F | |
| 2온스, 루어락 주사기 | BD(Beckton, Dickinson 및 Comp.) | 309653 - 60 mL | 오버필 ~65 ml |
| 현미경 | |||
| 도립 형광 현미경 Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, 형광/위상차 대물렌즈 | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12비트 흑백 CCD 카메라 | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| 현미경 자동화 | |||
| 셔터 위상차/형광 | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y 스테이지 | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| 포커스 모터 | PRIOR Scientific | H122 | |
| XYZ 제어용 조이스틱 | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| 프로스캔 컨트롤러 | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| 이미지 수집 소프트웨어 | Fraunhofer CMI | ||
| 플로우 셀 어셈블리 및 PDMS | |||
| 플로우 셀 | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | 엔지니어링 도면은 Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window는 Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc | NT48-543 | |
| 씰링 플레이트 | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| 에폭사이드 유리 슬라이드 | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS 마스터 | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | UPM-0005 (초정밀 플라이 절단기) |
| PDMS 슬라이드 디자인 | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| 튜빙 | |||
| 너트, 슈퍼 플랜지 없는 Tinytight, 헤드리스, 1/16 인치, PEEK, 녹색 | IDEX 건강 과학 | M-644-03 | 플로우 셀 입력/출력은 이 페룰 |
| 페룰, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS 잠금 링, 블랙 | IDEX 건강 과학 | M-657 | |
| 너트, 슈퍼 플랜지 없는 Tinytight, 헤드리스, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, 자연 | IDEX 건강 과학 | P-255 | |
| 페룰, 슈퍼 Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), 노란색 | IDEX Health Science에 대해 탭됩니다. | P-259 | Luer-lock 어댑터 |
| 튜빙, 테플론 FEP, .030 인치 x 1/16 인치 x 20 피트, 녹색에 적합합니다. | IDEX Health Science | 1520G | |
| 어댑터, 빠르게 여성 루어를 여성 1/4-28에 연결, PEEK, 빨간색 | IDEX 건강 과학 | P-658 |
참고문헌
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. ....
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