אברון תחבורה בתרבית דרוזופילה תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

סיכום

תאי דרוזופילה S2 ונוירונים בתרבית הם מערכות גדולות להדמיה של תחבורת אברון המונע באמצעות מנוע in vivo. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לculturing שני סוגי התאים, ההדמיה והניתוח של תחבורה שלהם.

תקציר

תאי דרוזופילה S2 מצופים על coverslip בנוכחות של כל תהליכי unbranched ארוכי צורת תרופת depolymerizing-אקטין מלאים microtubules אחיד מקוטב. אברונים לנוע לאורך תהליכים אלה על ידי מנועים microtubule. תחזוקה קלה, רגישות גבוהה לחלבון RNAi בתיווך לדפוק למטה והליך יעיל ליצירת שורות תאי יציבות להפוך תאי דרוזופילה S2 מערכת מודל אידיאלי ללמוד הובלת מטענים על ידי הדמיה לחיות. התוצאות שהושגו עם תאי S2 יכולות להיות מיושמות בהמשך ליותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מערכת: תחבורת אקסון בנוירונים העיקרי בתרבית מעוברי דרוזופילה ניתקו. נוירונים בתרבית לגדול neurites הארוכה מלאות microtubules ארוזים, דומה מאוד לתהליכי S2. כמו בתאי S2, האברונים בנוירונים בתרבית ניתן דמיינו ידי שני צבעי ניאון אברון ספציפי או באמצעות סמני אברון ניאון המקודדים על ידי DNA מוזרק לתוך עובריים מוקדם או לידי ביטוי בtransgenic זבובים. לכן, תחבורת אברון ניתן להקליט בקלות בנוירונים בתרבית על coverslips זכוכית באמצעות הדמיה חי. כאן אנו מתארים נהלים לculturing חזותי הובלת מטענים בתאי דרוזופילה S2 ונוירונים עיקרי. אנו מאמינים כי הפרוטוקולים הללו להפוך את שני המערכות נגישות למעבדות לימוד הובלת מטענים.

מבוא

תאי דרוזופילה S2 צברו פופולריות הולכת וגוברת ללימוד תהליכים תאיים רבים. תאים אלה התקבלו במקור מעוברים בשלב מאוחר trypsinized של OregonR תסיסנית ולשמור על תכונות כמו ^{מקרופאג-1.} תאי דרוזופילה S2 מציעים יתרונות רבים על פני שורות תאים אחרות. הם מתורבתים ב25 מעלות צלזיוס בלי CO _2, ויכולים להיות צילמו במשך שעות רבות בטמפרטורת חדר ללא הצורך בחימום או חילוף גזים. חשוב מכך, תאי דרוזופילה S2 רגישים מאוד לטיפול RNAi המאפשר מציאה יעילות גבוהה של חלבונים של עניין. תאי S2 הם transfectable מאוד יכולים להיות שנבחרו שורות תאי יציבות בפחות מארבעה שבועות, כדי לאפשר ביטוי אקטופי היציב של חלבונים של עניין. תאי S2 בדרך כלל גם לגדול מחוברים באופן רופף, אך לא התפשטו בבקבוק או בהשעיה. הם יכולים להיגרם להתפשט על coverslips precoated עם קונקה לקטינים צמחnavalin (ConA). הפריפריה של תאי ההתפשטות היא דקה במיוחד, ולכן הוא אידיאלי למיקרוסקופיה תא חי. ניתן למצוא בפרוטוקולים מפורטים לתרבות תאי S2, טיפול RNAi, הדמיה אור חי וimmunostaining ^ב2,3 הספרות. המעבדה שלנו אימצה תאי S2 כמערכת מודל ללמוד הובלת מטענים מבוסס microtubule. תאי דרוזופילה S2 שטופלו בכל תרופה שdepolymerizes או קוטעת F-אקטין, כגון cytochalasin D (CytoD), לגדול תהליכים ארוכים מלאים microtubules אחיד המקוטב ^{4 -10,} מה שהופך את מערכת אידיאלית ללמוד תנועת מטענים לאורך מערכי microtubule. פרמטרים שונים של הובלה בתהליכים אלו (. כלומר אורכי מסלולים, מהירויות, יווניות וכו ') ניתן למדוד בקלות באמצעות תוכנת מעקב חלקיקים אוטומטית, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; ד"ר . פסקל אלוטון: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-I# Nformatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx A4). תכונות אלו הופכות את תאי S2 מערכת מושכת ללימוד הובלת מטענים לאורך microtubules בתאים בתרבית רקמה.

ניסויי פיילוט בתאי S2 יכולים להתארך למודל חשוב מבחינה פיזיולוגית של מחקרי הובלת מטענים בנוירונים עיקרי דרוזופילה. בדומה לתאי S2, נוירונים בתרבית מעוברים ניתקו הם חדירים למולקולות קטנות, כגון צבעים ומעכבים, והדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של תחבורת אברון יכולה להתבצע בתאי עצב בטמפרטורת חדר. שימוש בדרוזופילה עם רקע גנטי שונה, אנו יכולים לבחון את תפקוד גן בנוירונים עיקרי בנוקאאוט (מוטציות אובדן של הפונקציה גנטיות), מציאה (הזרקת dsRNA או ביטוי) או ביטוי אקטופי (זבובים מהונדסים). באופן ספציפי, פיצול של סיבי אקטין באמצעות טיפול CytoD אינו מונע תולדת neurite, אלא הם גדלים מהר יותר, ובכך אנו יכולים ללמוד microtubule-dependeתחבורת אברון NT בנוירונים שטופלו CytoD ללא ההשפעה של אקטין חוטי ^11. לכן, תרבויות עצביות עיקריות לשלב את היתרונות של תאים בתרבית רקמה ולעוף גנטיקה, מה שהופך את מערכת נהדרת ללמוד הובלת מטענים במערכת רלוונטית פיזיולוגית ^10,12. מאז כמה מחלות ניווניות משפחתיות יכולים להיגרם על ידי או קשורה עם מומי הובלת מטענים (למשל מחלת פרקינסון ^13, מחלת הנטינגטון ^14, מחלת אלצהיימר ^15,16, Amyotrophic Lateral Sclerosis / ¹⁷ ALS, תסמונת HMN7B ופרי ^18,19, וסוג אטקסיה spinocerebellar 5/SCA5 ^20), תרבויות עצביות עיקריות יכולות להיות שימושיות בניתוח של ההשפעות של מוטציות מסוימות גורמות למחלות אלה בתחבורה microtubule תלוי.

לבסוף, מאפיינים חשובים של תחבורת microtubule תלוי הם נשמרים גם בין יונקים וזבובים, אבל התרבות גנטית ותאים דרוזופילה היא פחות יקרה וגוזל זמן, המצדיקה את השימוש בתאי דרוזופילה תרבותיים ללימוד היבטים חיוניים של תחבורת אברון בתנאים נורמלים ופתולוגיים.

פרוטוקול

1. תאי דרוזופילה S2

1. הכנת coverslips ConA המצופה

   1. הנח coverslips במעמד קרמיקה ולשטוף אותם על ידי טבילת חומצה כרומית במשך שעה 1. [זהירות: חומצה כרומית היא מאכל ויכולה לגרום לגירוי של עיניים, האף, גרון ועור].
   2. יש לשטוף ביסודיות עם coverslips פועל כל הזמן DH ₂ O למשך 30 דקות עד לחומצה הוא נשטפה לחלוטין.
   3. תן אוויר coverslips יבש ואת מעיל אותם עם ConA (פתרון 0.5 מ"ג / מיליליטר ב DH ₂ O) ל30 דקות.
   4. יש לשטוף coverslips עם DH ₂ O ל15 דקות ולתת להם להתייבש באוויר. ניתן לאחסן את coverslips ConA מצופה חודש 1.

2. ציפוי התא

   1. אפשר תאי S2 לגדול באופן אקספוננציאלי ^ב2 צלוחיות T25 או T75 סנטימטר בהתאם למספרם של תאים הנדרשים לניסוי.
   2. לספור את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer. מ 'צמיחת מיליליטר הוסף 1edium (למשל חרקים-Xpress) לתוך צלחת 35 מ"מ רקמת תרבות עם coverslip מצופה ConA, ובעדינות להעביר ~ 1 x 10 ⁵ תאים למנה. צפיפות תא זה היא אופטימלי עבור הדמיה, כי תהליכים מהתאים שונים אינם חופפים.
   3. על מנת לגרום להיווצרותם של תהליכים, מייד לאחר ציפוי מוסיף בינוני 1ml עם 5 CytoD מיקרומטר למנה (לריכוז הסופי של 2.5 מיקרומטר CytoD). לאפשר פיתוח מלא של תהליכים על ידי דוגרים התאים לפחות לשעה 2 ב C º 25 לפני ההדמיה.

2. דרוזופילה הראשית Neuron תרבות

1. הכנה לתרבות נוירון

   1. הכן את מדיום גידול עצבי דרוזופילה (הבינוני של שניידר בתוספת: 20% בסרום שור עוברי, חום מומת ב55 º C למשך 30 דקות; 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין; 100 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין; 10 מיקרוגרם / טטרציקלין מיליליטר) . sup זההמדיום של plemented שניידר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים.
   2. הכן בקבוקונים אגר מיץ תפוחים לאיסוף עוברי דרוזופילה (אגר 22.5 גרם, 12.0 סוכרוז גרם ו750 H ₂ O מיליליטר בבקבוק 2 ליטר; החיטוי ל20-25 דקות, להוסיף מיץ תפוחי מיליליטר 250 ויוצקים ~ 10 מיליליטר לכל דרוזופילה בקבוקון; לאחר התמצקות, חבר צלוחיות עם כדורי צמר גפן, ולעטוף את צלוחיות עם אריזות פלסטיק של מזון, כדי למנוע על ייבוש של המזון). מיץ התפוחים בצלוחיות אגר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בשקיות פלסטיק אטומות היטב במשך 4 שבועות.
   3. coverslips מעיל שטף חומצת 25 מ"מ המעגל עם ConA (ראה פירוט בפרוטוקול לתאי דרוזופילה S2) ולעקר אותם תחת אור UV ל10-15 דקות. coverslips אלה יכול להיות מאוחסן במשך חודש.

2. תרבות נוירון העוברית דרוזופילה

   1. בוגרים צעירים שמרו עף בצלוחיות אגר מיץ תפוחים בתוספת שמרים יבשים ל1-2 ימים לפני איסוף עוברים ואו הכנת נוירון.
   2. ביום האיסוף, על מנת לסנכרן את העוברים שנאספו, למבוגרים העברה טס לבקבוקון טרי תפוחי מיץ אגר לprecollection שעה 1 באור וזורקים עוברים אלה.
   3. העברת זבובים לבקבוקון אגר מיץ תפוחים חדש, לאסוף עובר במשך שעה 1, ולהעביר את הזבובים לבקבוקון נוסף לעוד שעה, גם בחושך כדי להגדיל את תשואת העובר.
   4. הסר את הזבובים הבוגרים מהבקבוקון אגר מיץ תפוחים ולתת לעוברים להתפתח 4 שעות נוספות לשלבי 9-11 בטמפרטורת חדר (4-6 עוברים HR-ישן הם בין השלב 9-11).
   5. הסר את העוברים על ידי התזת מים לתוך צלוחיות והתרופפות העוברים מאגרו מיץ התפוחים עם מכחול קטן (לפחות 10 עוברים נדרשים להכנת נוירון אחד טובה).
   6. מעביר את העוברים למסננת תא רשת ניילון 100 מיקרומטר עם טפטפת העברה לניקוז מים (prerinse טפטפת ההעברה במאגר דרוזופילה לשטוף עובר, 0.4% NaCl, 0.03% טריטוןX-100).
   7. לאסוף את העוברים מהמסננת באמצעות מכחול קטן, ולהעביר אותם לתוך 1.5 מיליליטר microtube מלא 1 מיליליטר לשטוף דרוזופילה עובר (הערה: לנקות סיבים אגר או כותנה באמצעות המכחול או הטיפים פיפטה). בפרוטוקול זה, microtube 1.5 מיליליטר מגיע עם העלי גלולה חד פעמי תואם.
   8. שטוף עוברים בשטיפת עובר דרוזופילה 3x.
   9. Dechorionate העוברים ב1:1 פתרון חדש של אקונומיקה מסחרית ו95% אתנול עבור 10 דקות [זהירות: אקונומיקה יכולה לגרום לגירוי עיניים, האף, גרון ועור].
   10. מעבר למכסת המנוע בתרבית רקמה, ולשטוף את העוברים 2x במדיום של שניידר בתוספת.
   11. השאר 200-300 בינוני μl בצינור עם העוברים, ועדינות מכאנית לנתק עובר Dechorionated באמצעות עלי גלולה חד פעמי קימבל צ'ייס כי כבר מעוקר ידי 70% אתנול (לטחון 10-15x).
   12. צנטריפוגה התערובת הומוגני ב20 XG במשך 2 דקות, וטרהnsfer supernatant לצינור טרי. [שלב זה הוא אופציונלי, זה מסייע להסיר עובר פסולת]
   13. צנטריפוגה supernatant ב 550 XG במשך 2 דקות עד גלולה תאים.
   14. Resuspend את הכדור ב500 μl בתוספת למטה התאים בינוניים וספין של שניידר שוב ב550 XG במשך 2 דקות, לחזור על מחזור resuspension מסתובב פעם אחת.
   15. לבסוף resuspend את הכדור ב~ 100 μl בתוספת הבינוני של שניידר וצלחת התאים על גבי coverslip מצופה ConA 25 מ"מ בצלחת פטרי 35 מ"מ סטרילי. דגירה של 10 דקות כדי לאפשר התקשרות סלולרי.
   16. הוסף 2 מיליליטר של המדיום של שניידר שיושלם, עם 5 מיקרומטר CytoD להטביע את coverslip עם תאים מצורפים.
   17. דגירה את הצלחת באינקובטור 25 מעלות צלזיוס humidified לילה לפני ההדמיה.

תוצאות

דרוזופילה S2 תאים המצורפים על התפשטות coverslip מצופה ConA לתוך סיבוב צורה "פנקייק" (איורים 1 א ו1C) שטוח. עם זאת, כאשר תאי S2 מצופים על coverslips בנוכחות CytoD ואפשרו להפיץ ל2-3 שעות, הם יוצרים תהליכים דקים וארוכים מולא על ידי microtubules המקביל (איורים 1B ו 1D). יש לי microtubules אלה קוטביות אחידה עם התוספת מסתיים החוצה ^7. דימות פלואורסצנטי זמן לשגות של דרוזופילה S2 יציבות להביע mCherry-טובולין מר...

דיון

כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ללימוד הובלת מטעני microtubule תלוי בתאי דרוזופילה S2 ותרבות הנוירון ראשוני. שני תהליכי S2 וneurites הם מבנים מולא על ידי מערכי microtubules ארוזים המשמשים כמסלולים לתחבורת אברון.

שתי אסטרטגיות משמשות בדרך כלל לאברונים תווית: transfection של וקטורי קידוד חלבון פלואורסצנטי עם רצף מיקוד אברון או כתמים עם צבעי ניאון הוסיפו ישירות לתרבויות. דוגמאות נפוצות של תוויות מטענם מופ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיום תאי חרקים אבקה (Schneider' s)	Sigma	S9895
חרק – אקספרס מדיום	פישר	BW12730Q
אינסולין	סיגמא	I6634
פניצילין	מוצרי מחקר בינלאומיים	P93000
סטרפטומיצין	מוצרי מחקר בינלאומיים	S62000
טטרציקלין הידרוכלוריד	סיגמא	T7660-5G
סרום בקר עוברי	אטלנטה ביולוגית	S11150
Concanavalin A	Sigma	C2010
Cytochalasin D	VWR	IC15077105
LysoTracker Red DND-99	בדיקות מולקולריות	L7528
100 ומיקרו; m מסננת תאים	Fisher Scientific	22363549
25 מ"מ זכוכית כיסוי עיגול	VWR	48380 080
Drosophila בקבוקונים	VWR	89092-730
עלי גלולה חד פעמיים עם מיקרו-צינורות תואמים	Kimble Chase	749520-0000