Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Органелл Транспорт в культуре Дрозофилы Клетки: S2 клеточной линии и первичных нейронов.

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50838

⸱

20 ноября 2013 г.

 ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2IKERBASQUE, Basque Foundation for Science

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Drosophila S2 клетки и культивируемые нейроны большие системы для визуализации с приводом от двигателя органелл транспорта в естественных условиях. Здесь мы опишем подробные протоколы для культивирования клеток обоих видов, их визуализации и анализа транспорта.

Аннотация

Drosophila S2 клетки высевали на покровное в присутствии любых актин-деполимеризации лекарственной формы длинных неразветвленных процессов, заполненных равномерно поляризованных микротрубочек. Органеллы двигаться вдоль этих процессов микротрубочек двигателей. Простота обслуживания, высокая чувствительность к РНК-интерференции-опосредованной белка нокдаун и эффективной процедуры для создания стабильных клеточных линий сделать дрозофилы S2 клетках идеальную модель системы для изучения Грузовой живого изображения. Результаты, полученные с S2 клетках может быть дополнительно применен к более физиологически соответствующие системы: аксонального транспорта в первичных нейронах, культивированных из диссоциированных эмбрионов Drosophila. Искусственный нейроны растут длинные нейриты наполненные комплекте микротрубочек, очень похожих на S2 процессов. Как и в S2 клетках, органеллы в культуре нейронов могут быть визуализированы либо органеллоспецифичными флуоресцентных красителей или с помощью флуоресцентных маркеров органелл, кодируемые ДНК вводят в ранних эмбрионов или выражается в трансгеннойМикросхема летит. Поэтому органелл транспорт может быть легко записаны в нейронах, культивируемых на покровные стекла с использованием живого изображения. Здесь мы опишем процедуры культивирования и визуализации грузовых перевозок в дрозофилы S2 клетках и первичных нейронов. Мы считаем, что эти протоколы сделать обе системы доступны для лабораторий, изучающих грузовых перевозок.

Введение

Drosophila S2 клетки приобрели большую популярность для изучения многих клеточных процессов. Эти клетки были первоначально получены из трипсинизировали конце эмбрионов стадии OregonR дрозофилы и поддерживать макрофагов-подобные функции 1. Дрозофилы S2 клетки имеют много преимуществ по сравнению с другими клеточными линиями. Они культивировали при 25 ° С без CO 2, и может быть отображены в течение многих часов при комнатной температуре без необходимости нагрева или газообмена. Что еще более важно, Drosophila S2 клетки очень чувствительны к лечению RNAi, позволяя высокой эффективности нокдаун интерес белков. S2 клетки очень transfectable и стабильные клеточные линии могут быть выбраны менее чем за четыре недели, чтобы позволить стабильную эктопическую экспрессию белков, представляющих интерес. S2 клетки обычно растут либо косвенное отношение, но не распространяются на колбе или в суспензии. Они могут быть вызваны для распространения на покровных предварительно покрытых с завода лектинов Конкаnavalin (КонА). Периферии распространенных клеток особенно тонкими и поэтому идеально подходит для живых клеток микроскопии. Подробные протоколы для S2 культуре клеток, лечения РНК-интерференции, живого изображения света и иммуноокрашивания можно найти в литературе 2,3. Наша лаборатория приняла S2 клетки в качестве модельной системы для изучения микротрубочек на основе грузовых перевозок. Дрозофилы S2 клетки, обработанные любой препарат, который depolymerizes или разрывает F-актин, например, цитохалазина D (CytoD), отращивать длинные процессы, заполненные равномерно поляризованных микротрубочек 4 -10, что делает его идеальной системой для изучения перемещения грузов по микротрубочек. Различные параметры транспорта в этих процессах (. Т.е. длины траектории, скорости, направленности и т.д.) может быть легко измерено с помощью автоматизированного программного обеспечения частиц отслеживания, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423, д-р . Паскаль Валлотон: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # а4). Эти свойства делают S2 клетках привлекательный систему для изучения грузового транспорта вдоль микротрубочек в клетках тканевой культуры.

Пилотные эксперименты в S2 клетках может быть продлен до физиологически важных модели грузовых транспортных исследований в дрозофилы первичных нейронов. Как и в S2 клетках, нейроны культивировали от диссоциированных эмбрионов проницаемы для малых молекул, таких как красители и ингибиторы, и с высоким разрешением живой визуализации органелл транспорта может быть выполнена в нейронах при комнатной температуре. Использование дрозофилы с различными генетическим фоном, мы можем исследовать функции генов в первичных нейронов нокаутом (генетические с потерей функции мутации), нокдаун (дсРНК инъекции или выражение) или эктопическая экспрессия (трансгенные мухи). В частности, фрагментация нитей актина с использованием лечение CytoD не мешает рост аксонов, вместо этого они растут быстрее, и, таким образом мы можем изучать микротрубочек-зависимнт органелл транспорт в CytoD обработанных нейронов без влияния нитей актина 11. Таким образом, первичные нейронные культуры объединить преимущества тканевых культур клеток и летать генетику, что делает его отличным системой для изучения грузовых перевозок в физиологическом соответствующей системы 10,12. Поскольку несколько семейные нейродегенеративные заболевания могут быть вызваны или связаны с грузовых транспортных дефектов (например, болезнь Паркинсона 13, болезнь Хантингтона 14, болезнь Альцгеймера 15,16, боковой амиотрофический склероз / ALS 17, HMN7B и Перри синдром 18,19, и спиноцеребеллярной Тип атаксия 5/SCA5 20), первичных нейронов культур может быть полезным при анализе эффектов специфических мутаций, вызывающих эти заболевания на микротрубочек в зависимости от транспорта.

Наконец, важные свойства микротрубочек в зависимости от транспорта хорошо сохраняется между млекопитающих и мух, но Дрозофилы генетической и клеточной культуры является менее дорогостоящим и трудоемким, оправдывая использование культивируемых клетках дрозофилы для изучения основные аспекты органелл транспорта в норме и при патологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Дрозофилы S2 клетки

  1. Подготовка покровные КонА покрытием

    1. Поместите покровные в керамической стойки и промыть их погружением хромовой кислоты в течение 1 часа. [ВНИМАНИЕ: хромовая кислота вызывает коррозию и может вызвать раздражение глаз, носа, горла и кожи].
    2. Промыть покровные тщательно постоянно работает дН 2 O в течение 30 мин, пока кислота не будет полностью размыты.
    3. Пусть покровные воздух сухой и покрыть их ConA (0,5 мг / мл раствора в дН 2 O) в течение 30 мин.
    4. Промыть покровные с дН 2 O в течение 15 мин, и пусть они высохнуть на воздухе. Покровные КонА покрытием можно хранить до 1 месяца.

  2. Покрытие клетки

    1. Разрешить S2 клеток экспоненциально растет в Т25 или Т75 см 2 колбах в зависимости от числа клеток, необходимых для эксперимента.
    2. Подсчитайте плотность клеток с помощью гемоцитометра. Добавить 1 рост мл мedium (например насекомых-Xpress) в 35 мм блюдо культуры ткани с покровным КонА покрытием, и аккуратно перенести ~ 1 х 10 5 клеток на блюдо. Эта плотность клеток является оптимальным для визуализации потому что процессы из различных клеток не перекрываются.
    3. Для того, чтобы вызвать образование процессов, сразу после посева добавить 1 мл среды с 5 мкМ CytoD на блюдо (до конечной концентрации 2,5 мкМ CytoD). Разрешить полное развитие процессов путем инкубации клеток по крайней мере в течение 2 часов при 25 º С до визуализации.

2. Дрозофилы Первичная Нейрон Культура

  1. Подготовка к нейрона культуры

    1. Подготовка Drosophila среду роста нейронов (средний Шнайдера с добавлением: 20% эмбриональной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием при 55 ° С в течение 30 мин, 5 мкг / мл инсулина, 100 мкг / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мкг / мл тетрациклина) . Эта поддержкасреднего дополненной Шнайдера можно хранить при температуре 4 ° С в течение 6 месяцев.
    2. Подготовка яблочный сок агар флаконов для сбора Drosophila эмбрионов (22,5 г агар, 12,0 г сахарозы и 750 мл H 2 O в 2-литровую колбу; автоклав на 20-25 мин, добавить 250 мл яблочного сока и залить ~ 10 мл в каждую дрозофилы флаконе; после затвердевания, подключите флаконы с ватными шариками, и оберните флаконов с пластиковой пищевой пленкой, чтобы избежать чрезмерной высыхание пищи). Яблочный сок в агар флаконах можно хранить при температуре 4 ° С в плотно закрытых пластиковых мешках в течение 4 недель.
    3. Пальто кислоты промывают 25 мм покровные окружности с ConA (подробности см. в Протоколе для дрозофилы S2 клетках) и стерилизовать их под УФ-светом в течение 10-15 мин. Эти покровные могут храниться в течение месяца.

  2. Drosophila эмбриональных нейронов культуры

    1. Держите молодых взрослых летит в яблочный сок агара флаконах с добавлением сухих дрожжей в течение 1-2 дней перед сбором эмбрионов еили препарат нейрон.
    2. На сбора день, с целью синхронизации собранные эмбрионов, перенос взрослых мух в свежую агаровую яблочный сок флаконе в течение 1 часа precollection в свете и отбросить эти эмбрионы.
    3. Передача летит к новому яблочный сок агар флакона, собирать эмбрионов в течение 1 часа, и передавать мух в другую пробирку еще в течение часа, и в темно увеличить выход эмбриона.
    4. Удалите взрослых мух от агара флаконе яблочного сока и пусть эмбрионы развиваются еще 4 ч до стадии 9-11 при комнатной температуре (4-6 час-старый эмбрионы между стадии 9-11).
    5. Удалить эмбрионов, впрыскивая воду во флаконы и ослабив эмбрионов из яблочного сока агар с небольшим кистью (не менее 10 эмбрионов необходимы для одной хорошей нейрона подготовки).
    6. Перенесите эмбрионы в нейлон сито петли клеток 100 мкм с пипетки для слива воды (prerinse на пипетки передачи в Drosophila эмбрион промывочного буфера, 0,4% NaCl, 0,03% TritonХ-100).
    7. Сбор эмбрионов от сетчатого фильтра с помощью маленькую кисть, и передавать их в микропробирку 1,5 мл, наполненный 1 мл Drosophila стирки эмбриона (Примечание: очистить любые агар или хлопковые волокна, используя кисть или наконечники). В этом протоколе микропробирку 1,5 мл приходит с соответствующим одноразового гранул пестиком.
    8. Вымойте эмбрионов в дрозофилы эмбрионов промыть 3 раза.
    9. Dechorionate эмбрионов в свежем 1:01 решения коммерческого отбеливателя и 95% этанола в течение 10 мин [ВНИМАНИЕ: отбеливатель может вызвать раздражение глаз, носа, горла и кожи].
    10. Переход к капот культуры ткани, и мыть эмбрионов 2x в обогащенной среде Шнайдера.
    11. Оставьте 200-300 мкл среды в трубке с эмбрионами, и осторожно механически отделить dechorionated эмбрионов с помощью Кимбл Chase одноразовые гранул пестики, которые были стерилизованы 70% этанола (измельчить 10-15x).
    12. Центрифуга гомогенизированной смеси при 20 мкг в течение 2 мин и TRAnsfer супернатанта в свежую пробирку. [Этот шаг является необязательным, это помогает удалить эмбриона мусора]
    13. Центрифуга супернатант при 550 мкг в течение 2 мин для осаждения клеток.
    14. Ресуспендируют гранул в 500 мкл дополненной среде и спин клетки Шнайдера снова при 550 мкг в течение 2 мин; повторить цикл ресуспендирование-спиннинг один раз.
    15. Наконец ресуспендируют осадок в ~ 100 мкл дополненной среде Шнейдера и пластины клеток на 25 мм КонА покрытием покровное в стерильной 35 мм чашки Петри с. Инкубировать в течение 10 мин, чтобы позволить прикрепление клеток.
    16. Добавить 2 мл среде, дополненной Шнайдера, с 5 мкМ CytoD погружаться покровное с прикрепленными клетками.
    17. Выдержите блюдо в увлажненной 25 ° С инкубатор ночь перед визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Drosophila S2 клетки, прикрепленные на КонА покрытием покровное распространения в плоской туре «блин» формы (1А и 1С). Однако, когда S2 клетки высевали на покровные стекла в присутствии CytoD и давали возможность распространяться в течение 2-3 ч, они образуют длинные тонкие процессы, заполненные параллельными микротрубочек (фиг.1В и 1D). Эти микротрубочки имеют равномерное полярность с плюс заканчивается из 7. Покадровый флуоресцентн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы представляем подробные протоколы для изучения микротрубочек в зависимости от грузовых перевозок в дрозофилы S2 клетках и первичной культуре нейронов. Оба процесса S2 и невриты являются структуры, заполненные комплекте микротрубочек массивов, которые служат треков для органелл транспорта.

Две стратегии обычно используются для органелл Label: трансфекции векторов, кодирующих флуоресцентный белок с последовательностью органелл-таргетинга или окрашивание с флуоресцентными краси...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Мы благодарим членов лаборатории Гельфанда которые внесли вклад в развитие этих протоколов. Исследования сообщили в настоящей публикации при поддержке Национального института Генеральной медицинских наук из Национального института здоровья в рамках премии числа R01GM052111 к VIG и Постановлением Правительства департамента Басков образования, университетов и исследований при награда числа BFI-2011-295, чтобы УДК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Порошковая клеточная среда для насекомых (Шнайдер' s)SigmaS9895
Насекомое – Xpress mediumFisherBW12730Q
ИнсулинSigmaI6634
ПенициллинИсследования Продукты ИнтернэшнлP93000
СтрептомицинРеспомицин Репортер Девайс ИнтернэшнлS62000
Тетрациклина гидрохлоридSigmaT7660-5G
Фетальная бычья сывороткаAtlanta BiologicalsS11150
Конканавалин АСигмаC2010
Цитохалазин DVWRIC15077105
LysoTracker Red DND-99Молекулярные зондыL7528
100 &микро; m Сетчатый фильтрFisher Scientific22363549
25 мм Круглое защитное стеклоVWR48380 080
Drosophila ФлаконыVWR89092-730
Одноразовые пеллетные пестики с подходящими микропробиркамиKimble Chase749520-0000

Ссылки

  1. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
  2. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
  3. Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982(2010).
  4. Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
  5. Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
  6. Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
  7. Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
  8. Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
  9. Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
  10. Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
  11. Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
  12. Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
  13. Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
  14. Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
  15. Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
  16. Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
  17. Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
  18. Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
  19. Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
  20. Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
  21. Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
  22. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
  23. Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
  24. Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
  26. Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
  27. Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
  28. Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Клетки Drosophila S2микротрубочковые моторыдеполимеризация актинавизуализация живых клетокфлуоресцентные маркерытаймлапс-визуализацияпокрытие конканалином Ацитохалазин D
Органелл Транспорт в культуре Дрозофилы Клетки: S2 клеточной линии и первичных нейронов.
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.