Analyser la dynamique des protéines en utilisant l'hydrogène change spectrométrie de masse

Résumé

conformation des protéines et la dynamique sont essentielles pour comprendre la relation entre la structure et la fonction des protéines. l'échange d'hydrogène couplé à haute résolution spectrométrie de masse est une méthode polyvalente pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines ainsi que la caractérisation de la protéine-ligand et des interactions protéine-protéine, y compris les interfaces de contact et des effets allostériques.

Résumé

Tous les processus cellulaires dépendent de la fonctionnalité des protéines. Bien que la fonctionnalité d'une protéine donnée est la conséquence directe de la séquence d'acides aminés unique, il ne se matérialise que par le repliement de la chaîne polypeptidique en une seule disposition tridimensionnelle définie ou plus couramment en un ensemble de conformations interconversion. Enquête sur le lien entre la conformation de la protéine et sa fonction est donc essentiel pour une compréhension complète de la façon dont les protéines sont en mesure de remplir leur grande variété de tâches. Une possibilité d'étudier des changements de conformation d'une protéine subit tout en progressant au travers de son cycle de fonctionnement est de l'hydrogène ^H-1/2 H-échange, en combinaison avec la spectrométrie de masse à haute résolution (HX-MS). HX-MS est une méthode souple et robuste qui ajoute une nouvelle dimension à l'information structurale obtenue par cristallographie par exemple. Il est utilisé pour étudier le repliement des protéines et le déploiement, la liaison de petit molecule ligands, les interactions protéine-protéine, des changements conformationnels liés à la catalyse enzymatique, et allostery. En outre, HX-MS est souvent utilisé lorsque la quantité de protéine est très limitée ou la cristallisation de la protéine n'est pas réalisable. Ici, nous fournissons un protocole général pour étudier la dynamique des protéines avec HX-MS et décrivons comme un exemple pour révéler l'interface d'interaction des deux protéines dans un complexe.

Introduction

Le nombre de structures cristallines des protéines et complexes de protéines a augmenté rapidement ces dernières années. Ils présentent des instantanés précieux de l'organisation structurelle de ces protéines et fournissent une base pour l'analyse structure-fonction. Cependant, la dynamique des protéines et les changements de conformation, qui sont essentielles pour leurs fonctions, sont rarement révélées par cristallographie aux rayons X. Cryo-microscopie électronique, d'autre part, est capable de capturer des complexes de protéines et des protéines dans des conformations différentes, mais en général ne peut pas résoudre les changements conformationnels jusqu'au niv....

Protocole

Une. Préparation de tampons et de protéines des échantillons

1. Préparer H ₂ O tampon. Utilisation Hsp90 tampon standard (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, KCl 50 mM, _MgCl2 5 mM, glycerol à 10%) en tant que H ₂ O tampon.
   Remarque: Si l'échantillon a été dialysée avant l'analyse, utiliser le tampon de dialyse H ₂ O tampon. Il est essentiel que le tampon D O ₂ se distingue de l'H ₂ O dans le tampon seul isotope de l'hydrogène. Tampons volatils comme NH ₄ CO ₃ ou NH _4-acétate ou tampons composants ne sont pas adaptés!
2. Prép....

Résultats

Hsp90 est un chaperon moléculaire dans la levure et de la famille de Hsp90 chaperone. En passant par un cycle du complexe ATPase il assiste fin des étapes de pliage d'un grand nombre de protéines clients. Pliage efficace nécessite un transfert de clients de Hsp70 et de l'interaction de la Sti1/Hop co-chaperon. STI1 se lie directement à Hsp90 et facilite la liaison par inhibition de l'activité d'ATPase de la protéine Hsp90 client. Interaction de Hsp90 avec DIT1 a récemment été étudiée en utilisant HX-MS ^23. Ic.......

Discussion

Liaison d'un partenaire d'interaction d'une protéine entraîne inévitablement des changements dans l'accessibilité au solvant sur le site de liaison. En outre, de nombreuses protéines subissent des changements conformationnels dynamiques lors de la liaison, qui touchent d'autres régions que l'interface de liaison réelle. HX-MS est une méthode robuste pour surveiller ces changements et est même capable de révéler des changements conformationnels de protéines sur des échelles de temps que d'autr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
Vanne 6 ports EPC6W avec actionneur microélectrique	Valco	#EPC6W
Vanne d’injection (manuel)	Rheodyne	#7725
Poros AL20	media Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
Pepsin	Sigma	#P6887	utiliser de la pepsine fraîche
Microbore (1 mm)	IDEX	#C-128
Microbore (2 mm)	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8	Column Waters Corp.	#186002876
Thermomixeur	Eppendorf	#5355000.011
Tubes (différents diamètres)	Raccords IDEX
	IDEX	#PK-110 avec PK-100