הפעלה של שלט מגנטי של בדיקות מיקרומטר באתר 3D מיפוי של תכונות פיסיקליות biofilm חיידקים

Summary

מאמר זה מציג את המתודולוגיה מקורית המבוססת על actuation מרחוק של חלקיקים מגנטיים זורעים בbiofilm חיידקים וההתפתחות של פינצטה המגנטית ייעודית למדידה באתרו את התכונות מכאניות המקומיות של החומר החי המורכב שנבנה על ידי מיקרו אורגניזמים בממשקים.

Abstract

הידבקות חיידקים וצמיחה בממשקים להוביל להיווצרות של biofilms מבנים הטרוגנית תלת ממדים שנקרא. תאי מגורים במבנים אלה מוחזקים יחד על ידי אינטראקציות פיזיות מתווכות על ידי רשת של חומרים פולימריים תאיים. biofilms חיידקים להשפיע על פעילות אנושית רבות וההבנה של המאפיינים שלהם היא קריטית לשליטה טובה יותר של ההתפתחות שלהם - תחזוקה או חיסול - תלוי בתוצאה השלילית או חיובית שלהם. מאמר זה מתאר מתודולוגיה חדשנית במטרה למדוד באתרו את התכונות פיזיות המקומיות של biofilm שהיה, עד עכשיו, בדק רק מבחינה חומרית מקרוסקופית והומוגנית. הניסוי המתואר כאן כרוך בהחדרת חלקיקים מגנטיים לbiofilm גדל זרע בדיקות מקומיות שיכול להיות מופעלים מרחוק מבלי להפריע את המאפיינים המבניים של biofilm. פינצטה המגנטית ייעודי היתה developed להפעיל כוח מוגדר על כל חלקיק המוטבע בbiofilm. ההתקנה היא רכוב על הבמה של מיקרוסקופ כדי לאפשר ההקלטה של ​​תמונות של התקופה מושך חלקיקי זמן לשגות. אז מסלולי החלקיקים המחולצים הרצף מושך ופרמטרי viscoelastic המקומיים נגזרים מכל עקומת עקירת חלקיקים, וכך לספק את הפצת 3D-המרחבי של הפרמטרים. השגת תובנות הפרופיל המכני biofilm הוא חיוני מנקודת המבט של מהנדס למטרות בקרת biofilm, אלא גם מנקודת מבט בסיסית כדי להבהיר את הקשר בין המאפיינים האדריכליים והביולוגיה הספציפית של מבנים אלה.

Introduction

biofilms חיידקים הם קהילות של חיידקים הקשורים למשטחים ביולוגיים או מלאכותיים ^1-3. הם יוצרים על ידי מנגנון הידבקות צמיחה בשילוב עם הייצור של תאי מטריקס פוליסכריד עשיר שמגן ומייצב את המבנה ^4,5. biofilms אלה אינם מכלולים פשוט פסיביים של תאים נדבקו למשטחים, אבל מאורגן ומערכות ביולוגיות מורכבות דינמיות. כאשר חיידקים לעבור מפלנקטון לאורח החיים biofilm, שינויים בביטוי גנים ופיזיולוגיה של תאים הם נצפו, כמו גם התנגדות מוגברת לantimicrobials ולארח הגנה חיסונית להיות במקור של זיהומים מתמשכים וכרוניים רבים ^6. עם זאת, הפיתוח המבוקר של מבני חיים אלה מציעים גם הזדמנויות ליישומים תעשייתיים וסביבתיים, כגון biore....

Protocol

1. חיידקי תרבות והכנת השעיה

1. פיק מושבה גדלה טרי מצלחת אגר Lysogeny מרק (LB), לחסן אותו ב 5 מיליליטר מדיום LB נוזלי המכיל 100 גר '/ מיליליטר אמפיצילין μ ו7.5 גר' / מיליליטר טטרציקלין μ ודגירה אותו במשך 5 עד 6 שעות ב 37 ° C ב רועד פלטפורמה.
2. לאחר מכן, להוסיף 100 l μ של תרבות החיידקים ב5 מיליליטר בינוני מינימום (M63B1) בתוספת גלוקוז 0.4% ואותם ריכוזי האנטיביוטיקה. דגירה לילה תרבות טרי בדילול זה על 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה רועדת.

Results

ניתוח טיפוסי יספק את הפריסה המרחבית של הפרמטרים viscoelastic בקנה מידת מיקרון בbiofilm חיים מבלי להפריע להסדר המקורי שלה. תוצאות אופייניות מוצגות באיור 7 שבו הערכים של ₀ J - ציות האלסטיות - מקבלים כפונקציה של Z-הציר לאורך העומק ושל ציר ה-Y לאורך ממד רוחב של biofilm. כל נקודה מתאימה לחרוז שניתוח עקום השרץ סיפק ערך J _0. נתוני המחקר מראה כי הציות מקומי מגוון לאורך העומק של biofilm על פני כמעט שלושה סדרי גודל, אלא גם כי הטרוגניות רוחב חזקה התרחש .......

Discussion

חלקיקים מגנטיים זה זריעה ומושכים ניסוי אפשר במיפוי 3D באתרו של הפרמטרים viscoelastic של biofilm גובר במצבו המקורי. גישה זו חשפה את ההטרוגניות מכאנית של א ' biofilm coli גדל כאן ונתן רמזים להצביע על רכיבי biofilm תמיכה בתכונות פיזיות biofilm, חזק המצביעים על משמעות בסיסית של המטריצה ​​תאית ולייתר דיוק מידת cross-linking שלה.

זיהוי תבניות תכונות מכאניות בbiofilm חיידקים הוא ח.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>טבלה 1: ריאגנטים ותאים
חלקיקים מגנטיים	טכנולוגיות חיים	14307D	חלקיק מגנטי מיקרומטרי, 2.8 ומיקרו;
אמפיצילין (אנטיביוטיקה)	סיגמא-אולדריץ'	A9518
טטרציקלין (אנטיביוטיקה)	סיגמא-אולדריץ'	87128
זן חיידקי MG1655gfpF	UGB, מכון פסטר, צרפת		מייצר F פילי על פני השטח שלו, עמיד בפני אמפיצילין וטטרציקלין.
<חזק>טבלה 2: נימים וצינורות
מסננים לזלוף ילדים	Prodimed-Plastimed	6932002
נימים מרובעים חלולים	מתכת מרוכבת Scientific	8280-100	מיוצר בזכוכית בורוסיליקט. ריבוע 0.8 מ"מ x 0.8 מ"מ
צינורות סיליקון פרוקסיד	VWR בינלאומי	228-0512	קוטר 1 מ"מ
צינורות סיליקון פרוקסיד	VWR international	228-0700	קוטר 3 מ"מ
<חזק>טבלה 3: גידול ביופילם
תמיסת מרק ליזוגני (LB)	Amresco-VWR	J106-10PK	מדיום סטנדרטי המשמש לגידול חיידקים.
פתרון M63B1	תוצרת		מדיום מינימלי סטנדרטי המשמש לגידול חיידקים.
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8270	משמש לייצור M63B1 בינוני עם 0.4% גלוקוז.
<חזק>טבלה 4:
מצלמת אלקטרוניקה EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
בקר חימום	מכשירי דיוק עולמיים	מחולל
	טכנולוגיות Agilent	33210A
מגבר כוח	תוצרת		זה נותן אות זרם עם אמפליטודות של עד 4 A.
משאבות מזרקים	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
פינצטה מגנטית	תוצרת		שני קטבים אלקטרומגנטיים, כל אחד מהם עשוי סליל נחושת עם 2,120 סיבובים בקוטר 0.56 מ"מ חוט נחושת וליבות סגסוגת מגנטית רכה (Supra50-Arcelor Mittal, צרפת) בצורת ריבוע על פי התוכנית המוצגת ב<חזק>איור 10. שתי הליבות מותקנות בקוטב הצפוני הפונה לקוטב הדרומי, על מנת ליצור כוח מגנטי בכיוון אחד לאורך הנימים. ראה פרטי חיווט סליל ב<חזק>איור 11.
<חזק>טבלה 5: אופטיקה
מיקרוסקופ הפוך	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		זהו יעד למרחק עבודה ארוך המאפשר תצפית על הביופילם לעומק.
מסנני אפיפלואורסצנטיים: 1) לפלואורסצנטיות ירוקה: Exc 480/20 ננומטר; DM 495; ב 510/20  2) לפלואורסצנטיות אדומה: Exc 540/25 ננומטר; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	תזוזה של חלקיקים בעת הפעלת כוח נרשמת באמצעות בלוק מסנן הפלואורסקס האדום.
טבלה 6: ניתוח תמונה
ImageJ	NIH - תוסף