Summary
קורטיזול (קורט) מצטבר בשערה הולך וגדל של בני אדם ופרימטים לא אנושיים. אנו מתארים שיטות לחילוץ וניתוח קורט שיער עם דיוק גבוה ורגישות. מדידה של שיער קורט היא טוב במיוחד מתאימה להערכת לחץ כרוני על פני תקופות של שבועות עד חודשים.
Abstract
הורמון לחץ קורטיזול (הקורט) משולב באיטיות לתוך פיר שיער גדל והולך של בני אדם, פרימטים לא אנושיים, ויונקים אחרים. פיתחנו ומאומתים שיטה להפקת קורט וניתוח מקוף רזוס שיער ולאחר מכן הותאם בשיטה זו לשימוש עם שיער קרקפת אנושית. בניגוד ל" דגימות נקודה "קורט מתקבלות מפלזמה או רוק, שיער קורט מספק מדד משולב של פעילות מערכת ההיפותלמוס, יותרת המוח adrenocortical (HPA), ומתח ובכך פיסיולוגי, במהלך תקופת התאגדות הורמון. בגלל שיער קרקפת אנושי גדל בשיעור ממוצע של 1 סנטימטר / חודש, רמות הקורט מתקבלות ממגזרי שיער כמה סנטימטר באורך עלולים לשמש כסמן ביולוגי של לחץ שחווה על פני מספר החודשים.
בשיטה שלנו, כל דגימת שיער נשטפה ראשון פעמיים בisopropanol כדי להסיר כל קורט מהחלק החיצוני של השערה שכבר הופקדה מזיעה או חלב. לאחר ייבוש,מדגם הוא קרקע לאבקה דקה כדי לשבור את מטריצת החלבון של השיער ולהגדיל את שטח הפנים להפקה. קורט מהפנים של השערה מופק לתוך מתנול, מתנול הוא התאדה, ותמציתו מחדש במאגר assay. קורט חילוץ, יחד עם סטנדרטים ובקרת איכות, הוא ניתח אז באמצעות immunoassay אנזים זמין מסחרי רגיש וספציפי ערכה (EIA). קריאת נתוני EIA מומר לקורט pg למשקל שיער אבקת מ"ג. בשיטה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לנתח קורט שיער בבני אדם, כמה מינים של קופים מקוק, חרגולים, כלבים, ודובי קוטב. מחקרים רבים הן מהמעבדה שלנו ומקבוצות מחקר אחרות הוכיחו את תחולתה הרחבה של קורט שיער להערכת חשיפה ללחץ כרוני בטבעי, כמו גם הגדרות מעבדה.
Introduction
מדידה של קורט בפלזמה, רוק, או לעתים בשתן או צואה שמשה כמדד ללחץ פיסיולוגי מאז הגילוי של Selye על תפקידו של ציר HPA במתח 1. למרות מאמרים רבים שפורסמו נוגעים פעילות HPA למצבים מלחיצים בחריפות, השדה כבר הקשו על ידי חוסר מדד פשוט ואמין של לחץ פיסיולוגי כרוני. בעיה זו נובעת מכך שהערכות פלזמה ורוק גם תשואה "נקודה" של פעילות HPA שחשופים לסטיות היממה ויכול להיות מבולבלת על ידי הפרעות סביבתיות. דגימות שתן וצואה להניב מדידות של קורט ו / או הפרשת המטבוליט כי ההיקף מספר שעות עד יום שלם בחלק ממקרים. איסוף דגימות מרובות באמצעות כל אחת ממטריצות אלו עשוי לספק מדד משולב גס של רמות הקורט לאורך זמן, עם זאת, אף אחת מהגישות הללו מספק מדד באמת לטווח הארוך של פעילות HPA והיענות של סאי זהגזע ללחצים כרוניים.
מדידת קורט בשיער החלה למלא את הצורך החשוב הזה בספרות המתח. מחקרים ראשוניים על ידי מספר מעבדות הפגינו את נוכחותו של קורט בשיער אנושי אך לא לחקור האם רמות קורט שיער השתנו כפונקציה של מתח 2. כמעבדה שלנו כבר מתעניינת שנים רבות בוויסות של ציר HPA קוף רזוס ידי גורמים חברתיים והתנהגותיות שונים 3, יצאנו כדי להקים ולאמת את שיטות להפקה וניתוח של קוף רזוס שיער 4. בהתבסס על ההנחה שהקורט נישא בדם משולב באיטיות וברציפות לשיער גדל, מטרת השיטה החדשה הייתה להשתמש ברמות של קורט שמקורם בשיער כמדד משולב של פעילות HPA על פני תקופות של שבועות עד חודשים.
כמה אתגרים מתודולוגיים נתקלו בפיתוח הפרוטוקול הנוכחי. ראשית, מחקרים קודמים הראו כי o כמויות קטנותו במחזור הקורט מופרשים בזיעה וחלב ולכן יכול מעיל החיצוני של השיער פיר 2. כדי לחסל לבלבל את הפוטנציאל הזה, פיתחנו הליך לשטוף קל שמופיע כדי להסיר קורט חיצוני עם השפעה מינימאלית על קורט נוכחת בתוך השערה הולך וגדל. לפיכך, קוף השיער נתון להליך זה (כלומר שתי שטיפות 3 דקות עם isopropanol) איבד כ 7-8% מכלל תוכן קורט שיער, ולשטוף שלישי הוסר פחות מ 1% יותר מסטרואידי המדגם 4. נראה שיש קורט חיצוני יותר בשיער אנושי, שכן באותו ההליך הוסר ממוצע בסך הכל 27% תוכן קורט מהדגימות (ק רוזנברג וג' מאייר, לא פורסמו). כמו קוף שיער, לעומת זאת, שטיפה נוספת הכילה הרבה פחות קורט (כ -7%) מאשר שתי שטיפות הראשונות. לכן, תוצאות משני קוף ושיער אנושי לתמוך בטענה שרוב (אם לא כל) קורט החיצוני ניתן להסיר תוך שמירת frac גדולtion של קורט בתוך מטריצת השיער הפנימית. שנית, מחקרי הפיילוט שלנו הראו גם כי שחיקה השיער לפני מיצוי התאוששות קורט גדלה באופן משמעותי מהמדגם, ככל הנראה על ידי השבירה פתוחה המטריצה חלבוניים המורכבת של השערה כמו גם להגדיל את השטח זמין לחדירת ממס. שתי שיטות שחיקה שונות פותחו, כל אחד עם יתרונות וחסרונות. יש שיטה 1, אשר עושה שימוש בטחנת כדור, היתרון של ייצור האבקה הטובה ביותר. עם זאת, טחנת כדור היא פריט ציוד יקר יחסית, ואם משתמש עם צנצנות טחינה סטנדרטיות וכדורים, הוא מסוגל טחינה רק שתי דגימות בכל פעם. דגימות קטנות הן גם קשות לעבד באמצעות טחנת כדור עם צנצנות טחינה רגילות. השיטה 2, אשר משתמשת beadbeater, היא פחות יעילה ביכולת הטחינה שלו. כתוצאה מכך, התאוששות קורט ממוצעת היא כ 10% נמוך יותר בשיטה זו בהשוואה לטחנת הכדור (נתונים שלא פורסמו). מצד השני, beadbeaterהוא הרבה פחות יקר מאשר טחנת כדור, יכולות להיות קרקע 16-24 דגימות בפעם בהתאם לדגם, והשיטה היא גם מתאימה למדגמים קטנים. בשל התאוששות ההפרש שהוזכר לעיל, רצוי להשתמש באותה השיטה שחיקה עבור כל הדגימות במחקר מסוים.
ברגע שדגימות השיער עברו עיבוד, הם חולצו עם מתנול וקורט בתמציות הוא מנותח באמצעות ערכת EIA מסחרית רגישה וספציפית שנועדה במקור למדידת קורט רוק. נהלי החילוץ וassay אומתו בחלקו על ידי הוכחת כי דילולים סדרתי של תמציות מדגימות קוף שיער הניבו קריאות EIA שדומות מאוד לקריאות המתקבלות מסטנדרטים קורט אותנטיים. לאחר מכן, אנו הראו כי קורט שיער (בנוסף לפלזמה וקורט רוק) היה רגיש ללחץ הגדול בחיים של רילוקיישן מנדט מנהלי של הקופים לרבעוני דיור חדשות 4,5. Presenנייר לא מספק תיאור מפורט של השיטות המשמשות באופן שיגרתי במעבדה שלנו לעבד את דגימות שיער אדם וקוף ולחלץ ולנתח קורט מדוגמאות כאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אוסף דוגמאות ואחסון
- שיער אדם
- לאבטח את כל אורכו של השיער שנדגמו (עד לעיפרון ברוחב קוטר) עם גומייה או סיכה. שיער גזור קרוב לקרקפת ככל האפשר (נזהר שלא ניק העור) עם מספריים נקיים. הערה: שטח הדגימה הסטנדרטי הוא הקודקוד האחורי של הגולגולת.
- חוקרים אחדים דיווחו על ירידה ברמות קורט שיער אדם עם מרחק מהקרקפת 6, אשר עשוי להיות בשל סחף מחשיפה חוזרת ונשנית למים ושמפו 7 (אם כי רואה Manenschijn et al. 8 ותומסון et al. 9 לתוצאות הפוכות ב שאין ירידה מגזרית נצפתה) כדי למזער את ההשפעה של "אפקט סחף" זה פוטנציאל, אנו ממליצים לאסוף מגזרי שיער הפרוקסימלי לקרקפת עם אורך שאינו עולה על 3 סנטימטר (בהנחת ששיעור צמיחה ממוצעת של 1 סנטימטר / חודש 10, 3 קטע סנטימטר מכיל Cאורט שהופקד על פני 3 החודשים האחרונים כ). כדי להשיג זאת, יש להשתמש בסרגל כדי למדוד 3 סנטימטר מהחתך הראשון ולחתוך שוב להניב מדגם 3 סנטימטר. הערה: ברגע שהשיער נחתך לאורך, זה כבר לא נחוץ כדי לשמור על הגדילים ביישור אלא אם המחקר כרוך בחיתוך המדגם למקטעים ארוכים 1 סנטימטר נפרדים להקים לוח שנה רטרוספקטיבה של תצהיר קורט על פני תקופת הזמן לפני הדגימה 6.
- מניחים את מדגם השיער בנרתיק עשוי מרדיד אלומיניום, מעטפת נייר נקייה או צינור 15 מיליליטר בורג יתר פוליפרופילן צנטריפוגות מהסוג המשמש לשטיפת מדגם. כמו הקורט הוא מאוד יציב בשיער 2, ניתן לאחסן דגימות ללא הגבלה ב -20 מעלות צלזיוס ובמידת צורך, נשלחות לילה בטמפרטורת הסביבה.
- הליך איסוף שיער צריך להיות מתורגל על מתנדבים והדגימות בפועל צריכה להישקל לפני היציאה למחקר מלא. שים לב: דגימות שיער כמו SMAll כ5-10 מ"ג ניתן לנתח באמצעות השיטות שתוארו כאן, למרות שזה רצוי לאסוף דגימות> 10 מ"ג כדי למזער את הסיכוי לקבלת קריאות EIA מתחת סטנדרטי הקורט הנמוך ביותר.
- שיער קוף
- לגלח את השיער (100-250 מ"ג) מהעורף באמצעות גוזז בעלי חיים סטנדרטי. לגלח קרוב לעור ככל האפשר, נזהר שלא לפגוע בעור ולגרום לדימום בגלל רמות קורט דם הן גבוהות מאוד בהשוואה לאלה שנמצאו בשיער. הערה: אזור הצוואר נבחר לדגימה שגרתית משום שהוא בדרך כלל מקור טוב לשיער וניתן להבחין בקלות לצמיחה מחודשת שיער לפני הדגימה מחדש.
- מניחים את מדגם השיער בנרתיק עשוי מרדיד אלומיניום או צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר בורג יתר פוליפרופילן. יש לאחסן דגימות שיער קוף ונשלחו באותו אופן כפי שתואר לעיל עבור דגימות שיער אדם.
- בגלל קוף שיער, שלא כמו שיער קרקפת אדם, גדל לאורך מסוים ולאחר מכן stגדל 11 אופים, זה בדרך כלל לא אפשרי במקרה זה להשתמש במרחק מהעור, כמו לוח שנה להפקדת קורט. עם זאת, אם בעלי חיים ניתן לדגום יותר מפעם אחת (לדוגמא, במהלך בחינות בריאות שגרתיות תקופתיות), רצוי לבצע גילוח ראשוני כדי לקבוע נקודת זמן תחילת המחקר ולאחר מכן reshave אותו האזור לאחר תקופת הזמן הרצויה שחלף. קורט במדגם השני הופקד במהלך הפסקת הגילוח-reshave, המאפשרת ייחוס מדויק של המדגם של תוכן קורט לפעילות HPA מעל המרווח ש5.
2. כביסה מדגם וייבוש
- כביסה
- מניחים כל דגימת שיער לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר בורג יתר פוליפרופילן.
- הוסף 5 מיליליטר של כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים isopropanol כיתה (HPLC) על צינור אחד ואחריו היפוך חוזר ונשנה במשך 3 דקות באמצעות כתף.
- למזוג isopropanol לתוך מיכל פסולת, לוקח גהם לא לאבד את כל של המדגם.
- חזור על השלבים 2.1.2 ו 2.1.3 עוד פעם אחת.
- יבוש
- ייבש את השיער לפחות 2-3 ימים על מנת להבטיח אידוי isopropanol מלא.
3. גריסה לדוגמא וקורט חליצה - שיטת 1 עבור דגימות גדולות
- טחינה לדוגמא
- הנח עד 250 מ"ג של שיער יבש לתוך 10 מיליליטר נירוסטה טחינת צנצנת יחד עם כדור נירוסטה 12 מ"מ בודד שחיקה.
- טוחנים את המדגם במשך 6 דקות במהירות של 25 הרץ באמצעות טחנת כדור.
- לשקול עד 50 מ"ג של אבקת שיער על איזון אנליטיים ולאחר מכן להעביר אותו לצינור microcentrifuge נקי 2.0 מיליליטר פוליפרופילן לחילוץ קורט לאחר מכן.
- חילוץ קורט
- הוספת 1.0 מיליליטר של מתנול HPLC כיתה לצינור microcentrifuge המכיל את מדגם האבקה.
- שווי צינור דגירה המדגם עבור 18-24 שעות בטמפרטורת חדר עם שותףהיפוך nstant באמצעות כתף.
- צנטריפוגה הצינורות ב 14,000 סל"ד במשך 1 דקות בטמפרטורת חדר כדי גלולה שיער האבקה.
- העבר 0.6 מיליליטר של supernatant לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מיליליטר, נזהר שלא להפריע גלולה של שיער אבקה.
4. גריסה לדוגמא וקורט חליצה - שיטה 2 לדגימות קטנות
- טחינה לדוגמא
- הנח עד 60 מ"ג של שיער לתוך צינור microcentrifuge preweighed 2 מיליליטר ברזל למכות חרוז.
- Reweigh הבקבוקון כדי להשיג את המשקל לדוגמא.
- הוסף שלושה חרוזים פלדת כרום 3.2 מ"מ לכל בקבוקון ולאחר מכן לטחון את המדגם לפחות 2 דקות במקצף חרוז. אם בדיקה חזותית מגלה כי המדגם נכתש מספיק, ולאחר מכן לבצע ליטוש נוסף ל0.5 או 1 דקות. שים לב: אין העברת שיער הקרקע שדרושה במקרה זה משום מיצוי קורט מתבצע באותו הבקבוקון כמו טחינה.
- חילוץ קורט
- הוסף 1.5 מיליליטר של מתנול HPLC כיתה לצינור microcentrifuge המכיל את מדגם האבקה.
- שווי צינור דגירה המדגם עבור 18-24 שעות בטמפרטורת חדר עם היפוך מתמיד באמצעות כתף.
- צנטריפוגה הצינורות ב 10,000 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר כדי גלולה שיער האבקה. הערה: חרוזים פלדת הכרום יישארו בצינור עם השיער במהלך שלבי המיצוי וצנטריפוגה, המהווה את מהירות צנטריפוגה נמוכה יותר בהשוואה לשיטת 1.
- העבר 1.0 מיליליטר של supernatant לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מיליליטר, נזהר שלא להפריע גלולה של שיער אבקה.
5. אידוי ממס וכינונה מחדש לדוגמא
- ייבש את מתנול או באמצעות מאייד ואקום או זרם של גז חנקן אם מאייד ואקום אינו זמין. אם נעשה שימוש במאייד ואקום, אדי מתנול יכולים להיות לכוד על ידי אמצעישל מלכודת קרה או מלכודת כימית מצוידות במחסנית פחם פעילה.
- בעקבות סילוקו של מתנול, מחדש את תמצית הקורט בנפח מתאים של חיץ EIA assay (diluent assay). אם ערכי קורט גבוהים יחסית צפויים, ולאחר מכן להשתמש במאגר בנפח של 0.4 מיליליטר או יותר. אם ערכים נמוכים יחסית צפויים, ולאחר מכן את עוצמת הקול יכול להיות מופחת ל0.2 מיליליטר או פחות כדי להגביר את הרגישות. הערה: 0.2 מיליליטר הוא נפח מספיק כדי להפעיל aliquots הכפולים של המדגם לפחות פעמיים במקרה בשידור חוזר של המדגם הנדרש.
- כך או assay המדגם מחדש מייד או להקפיא אותו ב-20 ° C לניתוח מאוחר יותר. הערה: אם המדגם מחדש קפוא, חשוב להימנע מסובלימציה במהלך תקופת ההקפאה מאז שינוי בנפח דגימה יוביל לערך קורט שווא כאשר החישובים הסופיים מבוצעים.
6. הקורט Assay ונתונים המרות
- Assay תמציות שיער עבורקורט באמצעות immunoassay אנזים רגישות גבוהה ערכה (EIA). הערה: אם משתמש ברוק מסחרי ערכת הקורט EIA, בצע את המלצות היצרן כמפורט בהוספת ערכת פרט לכך שבדיקת הדגימות יהיו aliquots הכפולים של כל תמצית שיער מחדש במקום דגימות רוק.
- הכן תמצית שיער בקרת איכות (QC) לשימוש בכל assay.
- לאסוף מספר דגימות שיער נוספים וגם לעבד אותם בנפרד כמו בשלבים 4.1 ו4.2 או בברכתם לעיבוד מדגם גדול כמו בשלבים 3.1 ו3.2.
- להתאדות הממס ולגבש מחדש את תמציות כמו בשלבים 5.1 ו5.2, ולאחר מכן בריכת תמציות מחדש מכמה דגימות בודדות או תקווינה.
- Aliquot נפח מתאים של נקווה לחלץ מחדש (למשל 0.10 מיליליטר) לתוך צינורות microcentrifuge בודדים ולהקפיא לשימוש מאוחר יותר.
- הפשירו ולהפעיל aliquot QC אחד בשני עותקים בכל microplate immunoassay לספק refeלורנס ערך קורט לבדיקת האיכות של כל ריצה.
- מקדם התוך assay של השונות (CV; מוגדר כסטיית התקן מחולקת בממוצע של קבוצת ערכים לדוגמא) יכול להיות מחושב על ידי ניתוח 10-12 QC בארות באותה הריצה, ואילו ניתן לחשב בין assay קורות חיים באמצעות ערכי QC פני קבוצה של ריצות. אם תוכנת microplate הקורא של אחד מחשב את קורות חיים לבארות כפולות המייצגות את תמצית כל שיער, ולאחר מכן בשיטה חלופית לקביעת קורות חיים התוך assay היא לחשב את הממוצע של ערכי קורות חיים בודדים אלה על פני כל הצלחת.
- אם כל תמצית מדגם תשואות קריאה גדולה יותר מאשר תקן הקורט הגבוה ביותר בEIA, אז aliquot נוסף של התמצית מדולל עם כמות מתאימה של חיץ assay וקריאת EIA שלאחר מכן הוא תיקן לגורם לדילול. דוגמאות גם נתחו באופן שיגרתי, אם קורות החיים לבארות הכפולות הוא> 10%.
- בגלל ערכות הקורט EIA נועדו למדוד קורט values בדגימות נוזל כגון רוק או פלזמה, את הפלט של תוכנת microplate הקורא חייב להיות מומר לסכום של קורט לכל יחידת משקל של שיער אבקה. הנוסחה הבאה ממירה את פלט assay במיקרוגרם / ד"ל לקורט pg לשיער מ"ג:
(A / B) * (C / D) * E * 10,000 = F
בי = מיקרוגרם / ד"ל מתפוקת assay; B = משקל (במ"ג) של השיער חשוף למיצוי; C = כרך. (במ"ל) של מתנול מתווסף לשיער האבקה; D = כרך. (במ"ל) של מתנול התאושש מהתמצית ולאחר מכן התייבש למטה; E = כרך. (במ"ל) של חיץ assay משמש מחדש את התמצית מיובשת; ו= ערך סופי F של ריכוז קורט שיער בpg / מ"ג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג את התדפיס מקבוצה מייצגת של דגימות שיער אדם (גבר בוגר ונושאים אנושיים נשיים) מעובד בשיטה 2 שחיקה וחילוץ. תוכנת מחשב הייתה בשימוש כדי ליצור את פלט הנתונים ולהתאים עקומת sigmoidal 4 פרמטר לסטנדרטי הקורט (איור 2). קורות החיים בין היטב מצלחת זה נע 0.01-5.73% עם קורות חיים התוך assay ממוצע של 1.34%. קורות החיים בין assay נקבעו באמצעות ערכי QC מתשעה מבחני שערת אדם האחרונים היה 4.41%. 37 הדגימות נותחו על צלחת זו הניבו מגוון של ערכי קורט שיער 3.1-650 pg / מ"ג (חציון = 10.2 pg / מ"ג; ממוצע ± SD = 36.0 ± 110 pg / מ"ג).
שיטת 1 משמש במעבדה שלנו לעבד את דגימות שיער מפרימטים לא אנושיים ובעלי חיים גדולים אחרים. Assay נציג של קוף רזוס שיער בוגר (רובם מהנקבות) הניב טווח ערכי קורט 50.1-102 pg / מ"ג (חציון = 75.0; ממוצע ± SD= 75.8 ± 14.0 pg / מ"ג). קורות החיים התוך assay הממוצע עבור assay זה היו 2.08%, וקורות החיים בין assay נקבעו באמצעות ערכי QC מתשעה מבחני קוף שיער האחרונים היה 4.63%.
איור 1. פלט תוכנה עבור assay קורט שיער אדם מייצג. בארות הכפולות הן כדלקמן: S1-S6 - סטנדרטים קורט החל 0.012 מיקרוגרם / ד"ל (S6) ל3.0 מיקרוגרם / ד"ל (S1); S7 - 0 בארות קורט; B1 - בארות ספציפיות מחייב (NSB), שאין נגד קורט נוגדן (התוכנה באופן אוטומטי מחסירה את הצפיפות הממוצעת NSB האופטית הערך [OD] מכל קריאות OD האחרות); C1 ו-C2 - כיילי קורט גבוה ונמוך המסופקים על ידי היצרן; T1 - QC;
T2-T38 - בדיקת דגימות. מC1 לT38, הערך העליון בכל תא במערך הוא valu OD נמדד דואר ממתאים היטב, והערך נמוך יותר בתא השמאלי של הזוג הוא ערך הקורט במיקרוגרם / ד"ל מחושב מהערך OD הממוצע. שים לב שT9 הדגימות וT31 הניבו קריאות מעל תקן הקורט הגבוה ביותר. כתוצאה מכך, שתי הדגימות היו מאוחר יותר בדילול פי 4 במדלל assay וניתוח מחודש. ערכי הניתוח המחודשים שימשו לאחר תיקון לגורם לדילול. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. עקומת סטנדרט של ערכי OD לעומת ריכוז יומן קורט לאותו assay שיער האדם. ערך R בריבוע שמוצג בפנל הוא הטוב מחושב התאמה של העקומה למידה./ "= היעד" _blank 50882/50882fig2highres.jpg "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הליך קורט שיער שתואר לעיל הוא פשוט לביצוע, הוא זול יחסית, הופך את השימוש בכימיקלים זמינים, חומרים כימיים, ואספקה, ודורש ציוד זה, למעט במקרה אחד, עשוי להיות נוכח במעבדה האנליטית טיפוסית. יוצא מן הכלל הוא מנגנון שחיקה כגון טחנת כדור או מיני beadbeater. נציין כי חלק מקבוצות המחקר בררו בדגימות שיער לרסיסים קטנים בערך 1 מ"מ אורך 12, אלא מבוססים על התצפיות שלנו אנו ממליצים לבצע טחינה במקום מיותר, אם זה בכלל אפשרי. תחום נוסף של וריאציה מתודולוגיות בספרות כרוכה או לא לשטוף את השיער לפני קורט חילוץ 13, ואם כן, מה לשטוף תנאים לשימוש. אם השטיפה לא מבוצעת, ואז אחד סיכוני האפשרות שתמצית מתנול תכיל לא רק קורט שולב באיטיות לאורך השבועות או חודשים של צמיחת שיער אלא גם להזיע ו / או קורט נגזרות החלב שהופקד לאחרונה עלפני השטח של השיער. מחקרים על דגימות דוב קוטב לתמוך בקיומם של שני שברים קורט בשיער: חלק קטן באופן רופף הנכנס להסרה על ידי שטיפה קצרה isopropanol של שיער ללא פגע, כי ככל הנראה מייצג בעיקר זיהום פני השטח, וחלק קטן יותר קשור בחוזקה כי הוא נגיש על ידי מיצוי נרחב של מתנול דגימות שיער אבקה 14. אותה המסקנה שניתן להסיק מהכמויות הקטנות יותר של קורט שחולצו מן קוף ואדם שיער על ידי שטיפה חוזרת ונשנית isopropanol (ראה מבוא). מצד השני, אם השטיפה מתבצעת, אז הבחירה של ממס ולשטוף תנאים יכולה להיות השפעה משמעותית על ערכי קורט וכתוצאה מכך. אגודת בדיקת השיער פרסמה הנחיות לבחירת ממס מתאים כדי למזער את שיער נפיחות וelution המומס פוטנציאלי מהפנים של מטריצת השיער במהלך תהליך השטיפה 15. למרות שהמלצות אלה פותחו ליישום לבדיקות סמים בשיער, הם מחדשלבנט לניתוח סטרואידים גם כן.
מדידת קורט בשיער ולא פלזמה או רוק מציעה מספר היתרונות 2. והכי חשוב, גישה זו מספקת סמן ביולוגי של רמות קורט משולבות על פני תקופות של שבועות עד חודשים, כי הוא מושפע על ידי הזמן של יום שבו דגימות שנאספו או על ידי חשיפה ללחץ קצר לפני לאוסף. אוסף שיער הוא לא פולשנית, אם כי דגימה של כמה מינים של בעלי חיים כמו קופים או דובי רזוס עשויה לדרוש הרדמה של הנושא מטעמי בטיחות. יתרון נוסף הוא שהקורט הוא מאוד יציב בשיער בהשוואה למטריצות מדגם אחרים, המאפשרת ניתוח של דגימות היסטוריות או ארכיונים, גם אם הם כבר מאוחסנים בטמפרטורת הסביבה לתקופה ארוכה של זמן. לבסוף, רמות הקורט בפלחי שיער אנושיים לחתוך במרחקים גדולים יותר ברציפות מהקרקפת שלעתים נעשו שימוש כדי ליצור לוח שנה רטרוספקטיבה של פעילות HPA לאורך זמן. במקרים כאלה הוא מיוחדחשוב ly להיות מודע להשפעה שהוזכר בעבר "כישלון", המיוצרת על ידי שטיפת שיער חוזרת ונשנית. למרות שחלק מהמחקרים לא הצליחו לשכפל את האפקט הזה 8,9, ראוי לציין כי במחקרים אלה הדגימות לא שטפו לפני מיצוי מתנול. הבדל המתודולוגי חשוב זה עשוי לעזור להסביר מדוע רמות קורט שיער לא ירדו עם מרחק מהקרקפת.
חלק מהמגבלות של גישת קורט השיער צריכים להיות גם ציינו. ראשית, גישה זו אינה יכולה לזהות שינויים במקצב היממה של פעילות HPA (כפי שראה בחלק מהחולים בדיכאון) או תגובת קורט התעוררות. רמות קורט השיער גם עשויות שלא לזהות את ההשפעה של גורמי דחק קצרים יחסית שחלו במהלך תקופת התאגדות הורמון. לפיכך, גישה זו צריכה להיות מחשבה של כמשלים למדידות של רוק ו / או קורט פלזמה, לא כתחליף למדידות כאלה. שנית, בעוד שהשימוש בקורט שיערסביר להניח שיהיה בעלת ערך מוסף לחוקרים המתעניייינים בגורמי לחץ פסיכולוגיים וסביבתיים, חשוב לזכור כי מוגבה פעילות HPA יכולה להתרחש תחת מגוון רחב של תנאים, כולל פעילות גופנית, הפרעות מטבוליות, ומחלות זיהומיות. שלישית, נתונים אילו היו קיימים משני בני אדם וקופים התומכים בהשערה כי קורט שיער נובע בעיקר ממחזור הדם 2, השערה זו עדיין לא מוכחת. ואכן, איטו ועמיתים לעבודה 16 הוכיחו את קיומה של מערכת כמו-HPA תפקודית בזקיקי שיער אנושיים microdissected נשמרה בתרבות איברים. המידה שבה זקיקי שיער יתרמו לקורט נמדד בשערה אינה ידועה בשלב זה.
בשנים ספורות מאז הקמתה כסמן הביולוגי חדש של פעילות ציר HPA, שיער קורט כבר נעשה שימוש במגוון רחב של יישומים על פני מינים רבים. רבים של יישומים אלה נופלים בתוך מספר לא גדולHemes נועד לקבוע כיצד פעילות HPA לטווח ארוך קשורה ללחץ כרוני, הפרעות אנדוקריניות כגון מחלת קושינג, או הפרעות נוירופסיכיאטריות כגון הפרעת דחק פוסט טראומטית 2,17-19. מחקרים אחרים השתמשו קורט שיער לבחון תפקוד ציר HPA ביחס לטמפרמנט התנהגות, התפתחות תקינה, השפעתם של גורמים התפתחותיים כגון חוויות ילדות מוקדמות בבני אדם או בתנאים שונים בגידול קופים, שמירה על איכות הסביבה של בעלי חיים פראיים, וחקירה רטרוספקטיבית של דגימות היסטוריות או בארכיון. מינים למדו עד כה ביחס לקורט שיער כוללים בני אדם, כמה מינים של פרימטים לא אנושיים (קופיים מקוק, קופי vervet, ובבונים), כלבים, חתולים, פרות, סוסים, וכמה מינים של דובים. סביר להניח כי השימוש בקורט שיער להערכת פעילות HPA לטווח ארוך, בין אם כדי לחקור את התגובה הפיזיולוגית ללחץ כרוני או לענות על שאלות ניסיוניות אחרות, ימשיך לשעברpand ושיחול על מגוון גדול עוד יותר של מינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין ניגודי אינטרסים להכריז.
Acknowledgments
אנו מודים Kymberlee אובריאן, סיליה מור, ואדוארד Tronick (חוג לפסיכולוגיה, אוניברסיטת מסצ'וסטס, בוסטון) עבור מתן דגימות שיער האנושיות נותחו במחקר זה, וסטיבן תיירות ואמנדה Dettmer (מעבדה של השוואתית אתולוגיה, NICHD) עבור מתן דגימות שיער קוף רזוס. פיתוח ראשוני והמשך שימוש בשיטה זו כבר נתמכה על ידי NIH RR11122 לMAN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0 ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2 mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10 ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12 mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Rotator for 15 ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipettor | |||
| Analytical balance |
References
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. Montagna, W., Dobson, R. L. IX, Pergamon Press. 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. an, H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. Ø, Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
