Создание человека моделей гематоэнцефалический барьер (BBB) может принести пользу исследования в условиях мозга, связанных с отказом BBB. Опишем здесь улучшенную методику для подготовки модели BBB контакта, что позволяет сокультивировани человеческих астроцитов и эндотелиальных клетках головного мозга на противоположных сторонах пористой мембраны.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) включает непроницаемые но адаптируемые капилляры мозга, которые плотно контролируют окружающую среду мозга. Выход из строя BBB была подразумеваемых в этиологии многих патологий головного мозга, создавая потребность в развитии человека в пробирке моделей BBB для оказания помощи в клинически соответствующих исследований. Среди многочисленных моделей BBB до сих пор описанных, статический (без потока), обратитесь ВВВ модель, в которой астроциты и эндотелиальных клетках головного мозга (БЭК) будут совместно культивировали на противоположных сторонах пористой мембраны, возникла как упрощенной еще аутентичной системы для моделирования BBB с высокопроизводительного скрининга мощности. Тем не менее, поколение этой модели представляет несколько технических проблем. Здесь мы опишем протокол для приготовления контакт человека BBB модели с использованием новой комбинацией первичных человеческих БЭК и увековечены человека астроцитов. В частности, мы подробно инновационный метод посева клеток на перевернутых вставками, а также указать INSERт методы окраски и примером того, как мы используем нашу модель для BBB-исследований, связанных с.
Введение
BBB является специализированным интерфейсом между периферического кровообращения и центральной нервной системы, что особенно важно, ответственного за поддержание мозга гемостаза. Она включает в себя различные мозговые микрососудистых эндотелиальных клетках (БЭК), которые функционально зависит от нескольких клеточных и бесклеточных компонентов (ниже) с образованием жесткой и динамический шлюз в мозг. В физиологических условиях BBB ограничивает прохождение клеток крови, плазмы и компонентов вредных веществ, все потенциально нейротоксические, в мозг. Параллельно с этим BBB выборочно обменивается ключевые ионы и питательные вещества (глюкоза и аминокислоты) и продуктов о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клеток (3-7 дней до BBB Ассамблеи)
1.1. Первичные элементы Человеческий мозг Микрососудистой эндотелия (БЭК)
БЭК были коммерчески получены. Клетки были произведены диспаза диссоциации нормальной человеческой коры головного мозга ткани и при условии, замораживали при прохождении 3 (<12 удвоений популяции).
- Субстрат: Пальто ткани культуры суда с "Приложение фактор", как в соответствии с инструкциями производителя.
- Обслуживание Сотовый: Поддержание БЭК в содержащей сыворотку полной среде. Для экспериментов, культуры БЭК в полной среде без сыворотки. Поддержание клет....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для того чтобы установить человека, контакт ВВВ модель мы должны были культивировать SVGs и БЭК на пористых мембран с размером пор 3 мкм, как показано, чтобы разрешить прохождение астроцитов конечных ног для контакта с эндотелиальных клеток 14,15,27,28. Схематическое представление полной контактной модели показан на рисунке 1 (слева рисунок). Основной технической задачей, представленный контактной системы является необходимости инициализировать астроциты против силы тяжести на abluminal повер.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Медицинские исследования в патологии мозга страдает много поступательное трудности. В области острого ишемического инсульта, например, многие препараты, которые показали большие перспективы в моделях на животных не удалось в клинике 38,39. Причины этих разочаровывающих результатов разнообразны и включают неверность доклинических тест-систем к сценарию человеческой хода и завышению результатов, полученных в результате исследований 21 животных. Одна из стратегий для улучшения прогностическую ценность.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Это исследование финансировалось за счет грантов, присужденных RLM от Национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (грант № 606658).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фактор прикрепления | Cell-Systems Corporation | 4Z0-210 | |
| Микрососудистые эндотелиальные клетки (БЭК) головного мозга, первичные, человеческие | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Полная среда | Cell-Systems Corporation | 4Z0-500 | Дополненная CSC JetFuel |
| Полная бессывороточная среда | Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | Дополнен CSC RocketFue |
| DMEM/F-12 с 15 мМ HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Добавка для роста эндотелиальных клеток (из бычьего происхождения) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Внешняя силиконовая трубка | Watson-Marlow | 913.A080.016 | Марка Pumpsil, внутренний диаметр 8 мм, стенка 1,6 мм Сыворотка |
| для теленка плода | Lonza | 14-501F | |
| Гентамицина сульфат | Life Technologies | 15750-060 | |
| Гепарин натрия | Pfizer | 1,000 Ед/мл | |
| Гексаметилдисилазан (HMDS) | Sigma-Aldrich | H4875 | |
| Микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга человека | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Внутренняя силиконовая трубка | Watson-Marlow | 913.A032.016 | Марка Pumpsil, внутренний диаметр 3,2 мм, стенка 1,6 мм |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer' s раствор гематоксилина | Amber Scientific | MH | |
| Minimum essential medium with Earle' s сбалансированный солевой раствор | HyClone Laboratories | SH30244.01 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Life Technologies | 15140 | |
| Крысиный коллаген I | Trevigen | 3440-100-01 | Вставки для |
| тканевых культур марки | Cultrex Corning Life Sciences | 3472 | Бренд Transwell, 6,5 мм в диаметре, с полиэфирной пористой мембраной, 3 & микро; m - размер пор |
Ссылки
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 3....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
Модель гематоэнцефалического барьеракультура эндотелиальных клетоккокультивирование с астроцитамивставка с пористой мембранойпокрытие коллагеноманализ с использованием флуоресцентных маркеровтрансэндотелиальное электрическое сопротивлениеглиальный фибриллярный кислый белокфактор фон Виллебрандаисследование проницаемости ТПА
