在心血管疾病（如高血压或心肌梗死）的鼠类模型中，心肌内细胞移植被广泛用于评估不同细胞类型在再生研究中的治疗潜力。因此，对该手术操作进行详细描述并提供清晰的可视化展示，将有助于明确在小型啮齿类动物中开展心血管细胞治疗分析的局限性与优势。
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本文内容
摘要
摘要
既往研究表明，细胞递送可通过释放细胞因子和多种因子，促进心脏组织的血管重建并提高细胞存活率，从而改善心脏功能。此外，进一步观察发现，某些特定干细胞（如心脏干细胞、间充质干细胞和心球细胞）能够分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞，进而整合到周围心肌组织中。
本文介绍了将非收缩性细胞可靠地递送至免疫缺陷小鼠左心室壁所需的材料与方法。该显微外科手术的关键步骤包括麻醉与镇痛剂注射、气管内插管、切开胸腔以暴露心脏，以及使用无菌30号针头和精密微升注射器将细胞注入心室壁。
组织处理包括心脏采集、包埋、切片和组织学染色，结果显示心肌内细胞注射在心外膜区域以及心室壁均造成轻微损伤。非收缩性细胞保留在免疫缺陷小鼠的心肌壁内，并被一层纤维化组织所包绕，可能起到抵御心脏压力和机械负荷的保护作用。
引言
已针对心血管疾病的小鼠和大鼠模型测试了多种细胞递送方案，旨在将该实验性操作在人类患者中的效率、有效性和安全性进行转化。在小型啮齿类动物心脏中，心肌内细胞递送是最可行的递送方法1,2，而在大鼠心脏中，也可采用顺行3和逆行4冠状动脉内细胞灌注。这两种方法各有局限性与优势。通过冠状动脉途径递送细胞在促进细胞广泛分布方面理论上优于直接肌内注射3，但也存在引发冠状动脉栓塞的风险3,5。心肌内递送的局限性则与机械性损伤、急性炎症及心肌损伤相关6,7。在人类中，用于心脏修复的细胞可通过经心内膜或外科心外膜途径进行心肌内注射，或通过冠状动脉内途径递送8。经血管途径注射适用于急性梗死且心肌已再灌注的患者，但在病变区域血管完全闭塞或血流较差的情况下可能无法实施9。通过经心内膜或经心外膜途径直接向心室壁注射在技术上是否可行，取决于患者的健康状况。事实上，已有研究表明该技术是安全的10,11，尽管经心外膜注射需要开胸手术，而经心内膜途径则需要对每位患者进行电生理标测，以区分存活的缺血心肌与瘢痕心肌区域9。
重要的是，在细胞治疗研究中，最适合移植的细胞类型仍有待确定。短期分析（4周）显示，注射定义为心脏球体（cardiospheres）的心脏干细胞12 或骨髓中的....
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方案
所有动物实验均依照国际（欧洲议会2010/63/EU指令）和国家（英国政府内政部1986年法案）法规进行。本文所述操作程序属于我们在英国许可机构授权下的工作计划内容，未以记录为目的而单独实施。
1. 细胞的制备
本方案以人胚胎肾细胞（HEK293细胞）为例，说明特定细胞系的制备过程。对于多能干细胞或成体干细胞向特定细胞谱系的培养与最终分化，必须采用针对具体细胞类型的实验方案。
- 在含有1%丙酮酸钠、2 mM谷氨酰胺、1%抗生素（青霉素/链霉素）和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（高糖，4,500 mg/L）中培养细胞。通常每两天更换新鲜培养基，一个10 cm培养皿按1:3比例传代。
- 用胰蛋白酶轻柔处理细胞1次 ，并按照1:1比例在DMEM培养基中重悬。
- 使用血细胞计数板计数细胞，并将3 × 106个细胞收集至另一离心管中。
- 在摆桶转子中以100 ×g离心5分钟。
- 弃去上清液，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀2次。
- 将细胞重悬于PBS 1× 中，浓度为106个细胞/50 µL，用于注射至免疫缺陷小鼠的左心室。
2. 术前条件
- 每次手术前，在温....
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结果
我们注射了HEK293细胞，这些细胞因其与心肌细胞不同的形态而易于区分（图1），呈鹅卵石状，而心肌细胞则呈细长形（图1A）。与心肌细胞（粉红色）相比，HEK293细胞对苏木精染料（蓝色）的反应更强，这可能是由于其细胞核含量更高所致（图1A）。为了进一步区分注射的细胞与宿主组织，我们在注射前2小时用DAPI对HEK293细胞进行标记。标记后的细胞在心肌组织中清晰可见，如图1E所示。对照假手术小鼠的心脏整体未显示任何损伤（图1C），组织完整性良好（图1D）。
在心脏的短轴整体切面图中，注射的细胞在注射区域呈现为均一的细胞团（图1B）。该细胞团周围包绕着一层薄薄的纤维化组织，在三色染色中表现为蓝色区域（图2A）。扫描电子显微镜显示，这些细胞未与宿主心肌组织相连（图2B），这可能与其无收缩.......
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讨论
在本研究中，我们展示了如何在小鼠心脏中进行心肌内细胞注射。作为该方法的验证，我们使用了HEK293细胞。需要特别强调的是，HEK293细胞并未用于任何细胞治疗研究，因此本研究的结果不适用于直接转化为治疗策略。然而，由于HEK293细胞不具备收缩功能，且不会转分化为其他细胞类型，这使得研究能够更加聚焦于技术层面，例如待递送细胞的特性以及递送途径。
据报道，心肌内注射途径 tends to 导致细胞簇嵌入心肌组织24,26，而冠状动脉内注射途径则可在损伤部位实现更均匀的分布。对于心肌细胞替代而言，理想的供体细胞应具备心肌细胞的电生理、结构和收缩特性，并能够从结构和功能上整合到宿主组织中，这表明在移植前有必要采用细胞分化程序。
成功手术的关键要点可总结如下：
- 使用注射类化合物麻醉小鼠，以减缓心率并便于细胞注射。
- 对小鼠进行气管插管，以维持肺部功能。
- 进行开胸手术时避免切割肌肉，以保持胸肌功能，确保呼吸正常。
- 暴露心脏后，在显.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Magdi Yacoub研究所（MYI）对显微成像分析及心脏修复相关项目的支持，感谢本单位动物实验中心的技术人员和负责人。本研究工作得到了英国心脏基金会（BHF）项目基金PG/10/019的资助。MPS由MYI和BHF共同资助。TP为BHF卓越研究研究员。NR为澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NH&MRC）研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 隔离器 | Pfi 系统 | 需要引用来源 | |
| 加热垫 | 兽医技术解决方案 | HE006 | 适用于小型动物 |
| 美托咪啶 | 国家兽医服务 | 需兽医处方 | |
| 盐酸氯胺酮 | 国家兽医服务 | 需兽医处方 | |
| 阿替美唑 | 国家兽医服务 | 需兽医处方 | |
| 脱毛膏 | 商业商店 | ||
| 布托啡诺 | NVS | 需兽医处方 | |
| Leica MZFLIII 显微镜 | Leica | 型号 S6E | 配备摆臂支架 TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer 数字切片扫描仪 | Hamamatsu | RS 系列 | |
| 扫描电子显微镜 | Jeol | JSM-6610 | |
| 钝头剪刀 | FST | 14084-09 | |
| Minivent 呼吸机 | Harvard Apparatus | 73-0043 | 包含小型 Y 型接头 (73-0027) 和插管套管 (73-2844) |
| 镊子 | FST | 11052-10 | |
| 牵开系统 | FST | 18200-20 | 适用于体重不超过 200 g 的动物的套件 |
| 30 G 12 mm；½ 英寸 | BBraun | A210 | 细黄色 |
| 微升注射器 | ESSLAB | 81201 | 另包含 Hamilton 重复分配器 PB 600-1，目录号 83700 |
| 6-0 丝线缝合线 | Ethicon | W1614T |
参考文献
- Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
- Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (199....
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重印与许可
