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方法論記事

無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

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DOI:

10.3791/51065

⸱

2013年11月19日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia, 3College of Engineering, Architecture and Technology, Oklahoma State University, 4University of Georgia, 5Department of Mathematics, University of California, Davis

この記事について

サマリー

本論文では、成人のゼブラフィッシュは、固定化された挿管、無傷の動物における記録と神経活動の操作を可能にするためのin vivo電気生理学的実験のために使用する方法について説明します。

要約

以前は、大人のゼブラフィッシュにおける電気生理学的研究では、準備をスライスまたはアイカップ製剤およびelectrorentinogramの録音をするために限られていた。本論文では、神経活動の記録を可能と大人のゼブラフィッシュは、固定化された挿管、およびin vivoでの電気生理学的実験のために使用する方法について説明します。大人の固定化は、頬やふたの運動の代わりにエラに溶存酸素を届けるためのメカニズムが必要です。我々の手法では、動物を固定し、この要件を満たすために生息地の水で灌流した。脳へのアクセスを提供するために、麻酔、開頭術を、トリカインメタンスルホネート（トリカインMS-222）の下で行われる。次電極は、次いで、細胞外脳活動を記録するために開頭ウィンドウ内に配置される。多管灌流システムを使用することにより、薬理学的化合物の種々の成魚に投与することができ、神経活性の任意の変化観察することができる。方法論は、神経学的活性の変化について説明するための観察を可能にするだけでなく、比較は幼虫および成体ゼブラフィッシュの間でなされることがまた可能にする。これは研究者により異なるライフステージでの様々な化合物の導入に神経学的活性の変化を識別することが可能になります。

概要

この記事では、プロトコルは、成人のゼブラフィッシュにおける神経活動のin vivoでの録音に得るために記載されている。細胞外記録方法は、神経組織の小領域内の電気的活動の電圧測定を提供するために使用される。調査のこの方法は、動物の挙動1に多数のセルを監視することを含む。以前は、スライス記録はアイカップ製剤および電図記録を持っているとして、大人と幼虫の両方で行われている。これらの実験は、主に様々な感覚系2-5の生理学的反応が詳細に行われている。最近まで、完全な脳標本は、呼吸と酸素の拡散が皮膚を通って発生する可能性がゼブラフィッシュの幼虫3,6,7、と電気生理学を実行するために利用されてきた。動物が完全に意識してOを意識したまま私たちの準備は大人のゼブラフィッシュのネイティブ神経学的活性を測定することができますFその周辺。

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） は、現在、遺伝毒性学、薬理および生理病理学的研究3のモデルとして基本的な役割を果たしている。彼らは遺伝、神経および内分泌レベル8での哺乳類との広範な相同性を共有しているため、ゼブラフィッシュは、神経科学の分野内での可視性を得ています。過去10年間で、標準的な神経解剖学的、および免疫組織化学的技法は、ゼブラフィッシュ神経系9-12の異なる神経伝達物質3,8,13の分布の詳細な特徴構成を決定するために使用されている。さらに最近では、研究者は行動のプロセス16〜19と感覚系2,13,20の電気生理学的特性を中心にその多くは機能的研究14,15、に焦点をシフトしている。これらの研究の少数ADULの特定領域の電気的活動に集中しているゼブラフィッシュ脳21-23トンが、in vivoでのアプローチを使用して実施されなかった。

このプロトコルは、特定の脳領域における活動のパターンを説明するためのゼブラフィッシュ神経系内で自発および誘発の両方の活性の電気生理学的研究のために適合させることができる。この技術の使用は、比較は若い幼虫期と成人の神経学的活性との間に行​​うことを可能にする。さらに、我々のプロトコルは、遺伝的または薬理学的変化との比較を可能にします。一緒にこのような遺伝子工学や薬理試験などの他のアプローチと、この方法は完全な成体動物においてだけでなく、このような遅発性てんかんや神経変性プロセスを研究などの潜在的なアプリケーションのために、神経細胞のコミュニケーションと可塑性の機能解析のための新たな可能性を提供しています。

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プロトコル

全ての実験手順は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に厳密に従って実施し、検討、承認、およびジョージア施設内動物管理及び利用大学によって監督されたプロトコル番号のA2011 09から003を、追跡した委員会。

1。機器のセットアップ

  1. 開頭のための灌流システム
    大人の固定化は、魚類への溶存酸素を届けるために挿管システムを必要とする。様々なシステムを利用することができる、60 mlシリンジからなる単純な重力システムが使用される。一貫して約1 ml /分の流速を与える高さに圧力ヘッドを上昇させる。この注射器は次いで、電気生理学的灌流システムのために使用される注射器と直列に配置することができる。
    1. シングル60ミリリットルルアーロック注射筒を取得し、プランジャーを外します。
    2. 約8＆に注射器を一時停止＃160;クランプを使用して、リングスタンドのベース上。
    3. 注射器の端部に1方活栓を接続します。活栓の反対側の端部に、挿管基部まで延びるのに十分な長さのチューブ片、直径2mmを接続する。
  2. 電気生理学のための灌流システム
    電気生理学的実験のために、それは、実験の経過中の種々の化合物を導入することがしばしば必要である。様々なシステムが利用可能であるが、直列に60ミリリットルの注射器からなる重力システムを使用することができる。このセットアップは、対応するストップコックを開くことによって実行されるべきソリューションの簡単なシリアル導入を可能にする。
    1. 2つ以上の60ミリリットルルアーロックシリンジを取得し、それぞれからプランジャを取り外します。 1つのシリンジを、後続の各チューブは、魚の薬理学的に多様な化合物を投与するために使用することができるが、魚に生息地の水を管理するために必要とされる。
    2. 3に各シリンジを接続して -ルアー接続の三方活栓。
    3. 1側にはオス型ルアーロックと直列に注射器を接続するために、外径（OD）のチューブに⅛を使用してください。
    4. 圧力ヘッドが前記ベースにある27の高さ、または一貫して約1 ml /分の流速が得られる高さまで上昇するようにデバイスを固定する。
  3. 挿管カニューレ
    挿管カニューレは魚への流体の導入を容易にします。このセットアップでは、最適な位置に動物の口の中にカニューレを、柔軟性と硬さの両方を提供します。
    1. はさみの任意の一般的なペア（ 例えば 。フィスカース）またはカミソリの刃を使用して、P-200ピペットチップのワイド端から1.5センチメートルセクションを削除します。
    2. ·ボーストアダプタすなわち雌ルアーロックキャップ、シリコーンフェルールと減圧弁にチューブ6センチ×1ミリメートルピースを挿入し、変更されたピペットチップに、このカニューレを挿入します。ルアーLの位置にピペットチップを保持直径の管に⅛の短い部分を使用してOCK。

      figure-protocol-1
      図1

  4. 挿管ベース
    この皿は、安定した、直立位置に固定化された動物を保持し、挿管を介して動物に入る流体の除去を容易にするために使用される。これが正しく確立されていない場合、プーリングは電気生理学的記録に侵入振動信号をもたらす、起こり得る。
    1. 100ミリメートルのX 15ミリメートルのプラスチック製ペトリ皿の底の皿を入手します。
    2. はんだ付けツールを使用して、皿の側面に穴、直径6mmとリムのリップ下の7.5ミリメートルを、溶融。同じツールを使用して、穴、直径10mm、皿の縁下の11ミリメートル〜から74°反時計回りにメルト小さい穴。この穴は排水孔として機能する。
    3. 終わりは終わりがブロックされることができないように持ち上げて穴の中に、直径1cm、チューブを挿入します。そして、小さな穴に、P-200ピペットマンチップを挿入し、これはダミーカニューレとして機能します。
    4. わずかに大きい穴の側面に上昇したペトリ皿で​​、カニューレ孔がちょうど覆われるように、溶融皿キャニングワックスを注ぐ。領域は、カニューレは、魚の口の中に〜3ミリメートル挿入することができるように、ストッパとして機能する。このセットアップは固化させるべきである。
    5. 難加熱された金属エッジを使用して、チャネルがカニューレの先端から始まり、約1〜2インチ伸びるように魚を保持するためのチャネルを彫る
      1. 注意排水口にカニューレ領域から連続下向きの角度が形成されることを保証するために注意しなければならない。065fig2.jpg "幅=" 400ピクセル "/>
        図2
  5. 灌流セットアップ
    1. 開始する前に、すべての気泡が除去されることを保証すること、生息地の水で灌流セットアップをフラッシュします。
    2. 〜0.016％の30ミリリットルを追加します（630μM）開頭灌流セットアップトリカイン溶液及びトリカインは、灌流開始時に動物に送達されることを保証するために、チューブを介して実行するために〜2ミリリットルを可能にします。希釈用のステップ2.2を参照してください。
    3. メイン灌流セットアップには、第1管に生息地の水〜50ミリリットルを追加します。残りのチューブのそれぞれに、任意の所望の実験化合物を追加します。
    4. 挿管ベースの小さな穴にカニューレのセットアップを配置します。
    5. タイトなスパイラルに42センチメートルのキムワイプの幅のストリップに1をねじるとキムワイプの両端に延びるようにドレナージチューブに挿入します。この組織は、灌流液を除去するために、芯となるとt内の流体の蓄積を防ぐために彼は、電気生理学的記録を妨げる可能性がベースを、挿管。
    6. 下端がすべて灌流廃棄物を収集するのに十分な大きさの不活性皿に拡張することができ、シャーレの大ホールにチューブの一方の端を差し込みます。この料理は、セットアップのための流出貯水池として機能します。一端が動物の腹部領域の近くに位置することになるように組織を置き、下の拡張は皿に滴下することができます。
    7. 解剖顕微鏡の近くに、この完成した挿管ベースを置きます。トリカイン灌流チューブにカニューレのルアーロックを接続します。
  6. 毛細管針と電極
    1. 銀線とセットアップをグランドに同一のワイヤの中15で構成する必要があり、二次電極に0.010の2.5からなる一次電極を入手します。二次電極の場合は、それがフィットすることを可能にするはんだ付け先端に銀線での0.010の項に15を使用ヘッドステージの後ろに。
      1. 塩化物イオンとのプライマリとセカンダリの両方の銀線の先端を電気。
      2. マイクロピペットプラーを使用して、<15mΩの抵抗と薄肉、ホウケイ酸キャピラリーニードルを引っ張る。
        1. 2-3 2 M塩化カリウムμlの、又は部分的に銀線の塩化物でコーティングされたチップをカバーするのに十分にキャピラリ針を埋める。
        2. キャピラリヘッドに、一次電極を挿入し、電極ホルダにマウント。
        3. マイクロマニピュレータにヘッドステージをマウントした後、第2マイクロマニピュレータに二次電極を取り付ける。各電極セットアップ、最初の位置にして、ヘッドステージの背面に二次電極のはんだ付けされ、先端にフィットします。

2。溶液の調製は灌流システム、および電気生理学的記録機器

  1. 生息地の水1Lを取得魚の水族館から。
  2. 0.016％のT】トリカインメタンスルホネート（トリカイン）（630μMの50ミリリットル）24。
    1. 0.4％トリス緩衝トリカイン、pHが7.2のアリコートを解凍。
    2. 生息地の水の47.9ミリリットルに0.4％トリス緩衝トリカインの2.1ミリリットルを加えて混合する。
  3. 希望の水溶性の実験化合物（ 例えば 300 mMののペンチレンテトラゾール、共通chemoconvulsant）のストック濃度を解凍する。
  4. リンゲル液中の1μgの/μlの臭化パンクロニウムの分量を解凍する。
  5. 麻酔や生息地の水で実験的な挿管システムの両方を記入し、チューブから全ての気泡を除去するために少なくとも十分な排水。気泡が動物の窒息につながる、流体の流れを妨げないために行われなければならない。
    1. 完全に接続するチューブに空気を許可せずに薬を保持する灌流チューブを排出します。
    2. 0.016％（630μM）トリカイン溶液で麻酔チューブを満たし、任意のexperを配置実験的潅流システムに追加の管（群）中imental化合物（複数可）。
      1. 実験灌流の最初のチューブは生息地の水が含まれている必要があります。
  6. 空の60ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿に生息地の水と場所の小さな気孔スポンジを湿らせます。麻酔薬を注入している間は、この皿は、魚を保持するために使用される。

3。開頭術

  1. それを道の約四分の三を埋めるために15×60ミリメートルペトリ皿に630μMのトリカイン液を十分に追加します。満たされた料理を量る。これはさらに、麻酔を腹腔内に注射することができるように動物を固定するために使用される。
  2. トリカインを含む皿に動物を浸して、再度、皿の重量を量る。
    1. 魚の重量を得るために、手順1と2の重量の差を減算します。
    2. 動物は穏やかでほとんど動きが止むまでトリカイン溶液中に残ることができます。
  3. 幅広いピンセットを使用して、予め湿らせたスポンジに魚を転送し、横方向に配置します。尾の魚を転送すると、このプロセスに適しています。
    1. 解剖顕微鏡下でスポンジと魚を置きます。
  4. 34 Gの針を含むナノフィルシリンジで、魚の重量の1μgの/ gが存在するように、十分な臭化パンクロニウムを測定します。
  5. 腹腔ナノフィル注射器を使用して臭化パンクロニウムを投与し、着実にそれを保持するために、魚の背側に沿ってアイスキャンデーの棒を使って。
  6. 細かい鉗子を使用して、下顎で魚をつかむとすぐに挿管ベースに動物を転送します。
  7. 位置動物は、1mmのカニューレが口の中に挿入することができるワックスフォームの背アップなどであるように。魚を操縦し、カニューレの周り、口を開くように細かい鉗子を使用してください。原因挿管トレイのメイクアップに、停止ができるように、ベースに設計されましたカニューレは、魚の口の中に3mmの挿入する。
    1. 一度位置に、トリカインを含む重力供給灌流チューブをオンにします。
  8. Kimqipe組織3cmの2セクションをカットし、生息地の水で濡らす。
    1. 乾燥を防ぐために動物を介して組織を配置します。キムワイプ部はまた、動物の背側ポップアップを保持するのを助けるために配置することができる。
  9. 解剖顕微鏡下では、光視蓋をカバー頭蓋〜2ミリメートル2項を削除するヴァンナ春のはさみを使用しています。このエリアには、目の後ろに座って暗い、骨板のように見えます。

    figure-protocol-2
    図3

    1. プレートの端にヴァンナはさみの1ブレードを挿入し、溶込みに十分な力で押す脳を貫通することなく、骨をTEを骨を切り取るためにハサミを閉じます。
    2. 骨の部分を削除します。
    3. 任意の血液が存在する場合、キムワイプのエッジを使用して削除します。一般的には出血はすぐに開頭を行った後に停止します。

4。電気生理学

  1. 挿管コックを切り、すぐにトリカインドリップに挿管ベースを接続するルアーロックを外します。
    1. 電気生理学顕微鏡にそのまま挿管セットアップを移動し、灌流システムに接続します。
    2. 生息地の水をオンにして、トリカインを洗い流すためには、〜1時間1ミリリットル/分の速度で灌流。
  2. 電極チップが動物の鼻孔内又は上顎背後浸漬中に挿入することができるように、視覚的制御下でマイクロマニピュレーターを使用して、二次電極を配置する。
  3. 開頭術開口部に、一次電極針を挿入します。挿入先端が光学蓋の中はかなり表面的に配置されるように、組織に針。
    1. 電極が深すぎる場合、電気信号​​は小さくてもよい。
  4. 一次および二次基準電極の間に記録された電気的な違いを収集して分析。このプロセスは、得られる細胞外記録を可能にする。
    1. 0.1 kHzでの低域通過フィルタ及び1Hzの高域通過フィルタを用いて、5 kHzのサンプリングレートでギャップフリーモードでデータを収集する。
    2. 生息地の水は45分の最小灌流まで、電気生理学的活動の記録を開始しないでください。
    3. 前の実験薬のほかに、少なくとも15分間のネイティブアクティビティのベースラインを記録します。所望の時間のための選択とレコードの実験薬で灌流を開始します。健康な製剤には、2〜3時間の神経活動を記録することができる。

5。クリーンアップ

  1. 実験の最後に、頭蓋や鼻孔から電極を削除して、挿管の設定を削除します。
    1. 米国獣医師会（AVMA）動物の安楽死（2013年）のためのガイドラインで概説したように、受け入れ慣行に従ってトリカインを使用して、薬物の過剰摂取により動物を安楽死させる。
    2. 安楽死させなければならゼブラフィッシュは、200〜500ミリグラム/ Lでトリカイン溶液中に配置する必要があります魚は、それらが死を確実にするために安楽死（頸部離断）の物理的手段に供されるまでのリズミカルなふたの活性の中止後10分の最小、溶液中に残されるべきである。
  2. 灌流セットアップに挿管ベースを接続するルアーロックを外します。適正処理のための灌流システムに残っている液体を回収する。
    1. すべての管を通ってDI水を実行し、危険な場合には、適切な処分のために収集します。
  3. 灌流システムを消毒するために、R国連の70％エタノールすべての管を通って、適切な廃棄のために収集します。
    1. 空気乾燥を促進するために開いた位置に各チューブのためのコックを残す。
    2. 70％エタノールで電極を浸し、空気乾燥させ。
  4. シャープコンテナの主電極に用いられるキャピラリーニードルを処分。
  5. 挿管のセットアップを解体し、水ですべてのピースをすすぐ。
    1. 70％エタノールで各部分をきれいにし、空気乾燥させ。

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結果

このプロトコルは、 インビボで 、成体ゼブラフィッシュの神経活動を測定するために使用されてきた。これらの電気生理学的記録は、一貫して再現性が得られる。ペンチレンテトラゾール（PTZ）、共通chemoconvulsant 6,7,25,26は 、挿管に導入すると、図5は、大人のゼブラフィッシュの神経活動の本来の誘導変化の代表例を示すセットアップ。

成体ゼブラフィッシュの天然の神経学的な活性は、各実験（ 図5A）をモニターした。これは、一貫してこの活性は、記録期間中振幅が自発的で小さいことが観察された。システムへの15 mMのPTZの導入後、自発的なてんかん様放電は、約5分を開発し始めた。導入後。この活動は、最初は簡単な、小さな振幅であり、頻繁に発生し、幼虫Z以内に観察されたものと同様ebrafish 6,7。 PTZ、活動のより小さく、より頻繁なバーストとその後の沈黙期間（ 図5B）が続いた開発大振幅放電の一貫したパターン...

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ディスカッション

このプロトコルは、 インビボで 、成体ゼブラフィッシュの神経活動を測定するために使用されてきた。記録された活動の特性（振幅やイベントの形状が）個々の魚の間で変化させることができるものの実際に、神経活動は、一貫して観察することができます。細胞外記録技術の利用は、この観察を説明することができます。この方法は、地域1内の細胞が多数の同時モニタリングを提供していますので、一次電極の位置の変化は観察された活性の役割を担うことができます。一次電極の深さも測定されている地域が変更されます。電極の先端があまりにも深い領域内に配置されている場合は、観測された信号は、予想よりも小さくなり、活性の変化を観察することが困難になりますが、これが発生した場合、チップはより表面的に座っているように、単純に一次電極を引き戻す。これは光学蓋の特徴であるともしていないのでご注意くださいアンは、脳の他の地域で深さを見た。しかし、この手順は、脳の異なる領域内で行うことができた。観察された神経活動は、実験中にベースラインレベルに減少し、魚はまだ生きている場合、それは不確実である場合には、頭蓋から電極を削除し、血液の流れが動物全体でまだある...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

この作品は、（TMD、JDLとATに）、NIH / NINDS助成R01NS070159によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
70% エタノールデコン研究所2750HC100% から 70% を DI 水で希釈
2 M 塩化カリウムJ.T. Baker
2 M 塩化ナトリウムJ.T. Baker3624-05
0.4% Tris-Buffered TricaineSigma-AldrichE10521pH 7.2-7.4; -20 oC で保存
化パンクロニウムSigma-AldrichP19181 μg/μl 1x リン酸緩衝生理食塩水
生息地水pH 7.0-7.4、導電率 400-450 μS;Instant Oceanおよび重炭酸ナトリウム
ペンチレンテトラゾールSigma-AldrichP6500されています1xリン酸緩衝生理食塩水Nanofilシリンジで300mMに希釈されています
World Precision Instruments、Inc.06A
34G 斜め針ワールド・プレシジョンズ・インスツルメンツ(株)NF34BV
スポンジ毛穴と化学薬品フリー
フォームで裏打ちされた細かいサンドペーパー5x 5 cm < sup>2< / sup>は十分な大きさです
ワニ口クリップ
バッテリー
37 cm x 42 cm必要 KimwipeKimberly-Clark ProfessionalTW31KEM
11 cm x21 cm KimwipeKimberly-Clark ProfessionalTW31KWP
直径 1/8 インチ チューブ
直径 1 cm
直径 1 mm
メス ルアー ロック キャップとシリコン フェルール付きレデューシングバルブ Qosina51505
顕微鏡 (ライカ MZ APO)別の顕微鏡は
中古バンナハサミRoboz Surgical Instruments Co., Inc.15018-10
60 ml ルアーロックシリンジチューブベクトン、ディキンソン、カンパニー309653
ルアー接続
ルアー接続付き 1 ウェイ ストップコック ルアー接続
フィッシャーブランド 100 mm x 15 mm シャーフィッシャー サイエンティフィNC9299146
フィッシャーブランド 60 mm x 15 mm シャーフィッシャー サイエンティフィックS67961
4 ホウケイ酸毛細管World Precision InstrumentsTW100F-4フィラメントを含有 溶液
P-97 Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instrument Co.
Digidata 1440Molecular Devices
Axon Aloclamp 900AMolecular Devices
Axoclamp softwareMolecular Devices
HS-9Ax 1U headstageMolecular Devices
0.010 in Silver WireA-M Systems, Inc.
Qシリーズ電極ホルダーワーナー・インスツルメンツQSW-A10P
10ml ルアーロックシリンジ
1mm x 15インチ チューブルアーロックシリンジをQシリーズ電極ホルダーに接続
マイクロマニピュレーターワーナー・インスツルメンツは2台必要
マイクロソフト社製PCデル
・ファラデーケージ
エアテーブル
解剖顕微鏡
臭 を によって維持小さな付きワイヤー 2 チューブ チューブ 付き 3 方向ストップコックレ ック レ

参考文献

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