Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.
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Article de méthode
Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Malgré la disponibilité du traitement et du vaccin, la tuberculose (TB) reste l’une des infections bactériennes les plus mortelles et les plus répandues dans le monde. Depuis plusieurs décennies, l’explosion soudaine de souches multirésistantes et largement résistantes aux médicaments constitue une menace sérieuse pour le contrôle de la tuberculose. Par conséquent, il est essentiel d’identifier de nouvelles cibles et voies critiques pour l’agent causal de la tuberculose, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)et de rechercher de nouveaux produits chimiques qui pourraient devenir des médicaments antituberculeux. Une approche consiste à mettre en place des méthodes adaptées aux écrans génétiques et chimiques des bibliothèques à grande échelle permettant la recherche d’une aiguille dans une botte de foin. À cette fin, nous avons développé un test phénotypique en nous appuyant sur la détection de Mtb marqué par fluorescence dans les cellules hôtes marqués par fluorescence à l’aide de la microscopie confocale automatisée. Ce test in vitro permet une quantification basée sur l’image du processus de colonisation de Mtb dans l’hôte et a été optimisé pour le format de microplaque de 384 puits, qui convient aux cribles de siRNA, de composé chimique ou de Mtb mutant-bibliothèques. Les images sont ensuite traitées pour l’analyse multiparamétrique, qui fournit la lecture inférer sur la pathogénie de Mtb dans les cellules hôtes.
Introduction
Parmi les agents pathogènes infectieux émergents et réémergents signalés au cours des dernières années, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)occupe une place de choix en étant responsable de 1,4 million de décès et de 8,7 millions de nouvelles infections en 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Malgré la disponibilité de thérapies multidrogues, le nombre de personnes infectées est toujours en hausse et multirésistante (MDR) ainsi que le Mtb très résistant aux médicaments (XDR) se propagent rapidement dans le monde entier1. De plus, si l’on tient compte de la présence d’antigènes Mtb, il e....
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Protocole
1. Criblage à haut débit de l’ARNsi à l’échelle du génome
Criblage effectué dans une lignée cellulaire humaine de pneumocytes de type II modèle A549 lors de l’infection par Mtb H37Rv exprimant la protéine fluorescente verte (GFP). Cette procédure est décrite à la figure 1A.
- Remettre en suspension la bibliothèque d’ARNsi séchés qui est stockée dans des plaques mères (plaques de 96 puits) avec 1x tampon d’ARNsi pour atteindre une concentration de 4 μM, puis transférer 10 μl du mélange dans une plaque fille de 384 puits (plaque fille 1).
- Ajouter 10 μl de tampon d’ARNsi 1x dans la plaque fille 1 pour diluer ....
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Résultats
Criblage à haut débit de l’ARNsi à l’échelle du génome
Mtb est capable de coloniser les cellules immunitaires in vitro ainsi que plusieurs autres cellules épithéliales pulmonaires. Par exemple, Mtbest capable d’infecter et d’endommager les cellules épithéliales A549 qui sont couramment utilisées comme modèle pour les pneumocytes humains de type II5-7. Dectin-1 a été rapporté comme un récepteur de la cellule hôte impliqué dans l’absorption de Mtb, la .......
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Discussion
Nous décrivons ici les méthodes requises pour un essai phénotypique utilisant une contrainte de Mtb H37Rv exprimant GFP pour infecter les cellules hôtes fluorescentement étiquetées, ce qui le rend approprié pour des écrans à haute teneur/à haut débit. Ce protocole pourrait être appliqué à un large éventail de composés, de sondes fluorescentes et de mutants Mtb. Pour chaque protocole décrit ci-dessus, des étapes de fixation et d’immunomarquage pourraient être effectuées avant l’acquisition de l’image. No.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu financièrement par la Communauté européenne (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), l’Agence Nationale de Recherche, le Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed), et la Région Nord Pas de Calais. Nous remercions Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni et Frank Lafont de la plateforme BICeL pour leur assistance technique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| et micro ; Plaque transparente noire, 384 puits | Greiner Bio-One | 781091 | 127,8/86/15 MM avec couvercle, |
| CellCarrier traité TC Plaque 384 puits | PerkinElmer | 6007550 | Noir, Fond transparent, avec couvercle, Fond |
| en V traité TC blanc, Plaque 384 puits | Greiner Bio-One | 781280 | ; |
| ruban d’étanchéité, respirant, stérile | Corning | 3345 | ; |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | réactif de transfection |
| Diméthylsulfoxyde | Sigma-Aldrich | 34943 | ; |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Milieu de culture cellulaire |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco' ; s Tampon Phosphate Salin |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco' ; s Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovin | sérum Life Technologies | 2610040-79 | ; |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll pour la purification des cellules monocytaires du sang périsphérique |
| Microbilles CD14, humain | Miltenyi | 130-050-201 | Purification des monocytes CD14+ |
| M-CSF humain, gr. premium (1000 &mu ; g) | Miltenyi | 130-096-493 | Facteur de stimulation des colonies de macrophages |
| LS Colonnes | Miltenyi | 130-042-401 | Colonnes pour l’isolement des monocytes CD14+ |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Culture de mycobactéries |
| Glycérol haute pureté ; | Euromedex | 50405-EX Culture de | mycobactéries |
| ; Middlebrook Enrichissement OADC | Becton-Dickinson | 211886 | Culture de mycobactéries |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Culture de mycobactéries |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Solution de dissociation cellulaire non enzymatique |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Colorant des noyaux |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Colorant des noyaux |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Colorant noyaux/cytoplasme |
| Formol | Sigma-Aldrich | HT5014 | Solution de fixation cellulaire |
| siRNA ciblant Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | ; |
| *siGenome* Pool de siRNA non ciblé ; | Dharmacon | D-001206-14 | ; |
| Rifampicine | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotique |
| Isoniazide (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotique |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotique |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | |
| Microscope confocal automatisé OPERA | PerkinElmer | Acquisition d’images | |
| Base de données serveur Columbus 2.3.1 | PerkinElmer | Transfert, stockage et analyse de données | |
| Logiciel Acapella 2.6 | PerkinElmer | Analyse basée sur l’image | |
| Logiciel GraphPad Prism5 | statistique | GraphPad | |
| Excel 2010 | Microsoft | Analyse statistique |
Références
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of l....
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