Qui descriviamo un saggio fenotipico applicabile agli schermi ad alta produttività /alto contenuto di RNA sintetico (siRNA), composto chimico e librerie mutanti Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa sul rilevamento di Mycobacterium tuberculosis con etichetta fluorescente all'interno di una cellula ospite etichettata fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata.
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Articolo metodologico
Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante la disponibilità di terapia e vaccino, la tubercolosi (TB) rimane una delle infezioni batteriche più mortali e diffuse al mondo. Da diversi decenni, l'improvvisa esplosione di ceppi multi- ed estesamente resistenti ai farmaci è una seria minaccia per il controllo della tubercolosi. Pertanto, è essenziale identificare nuovi obiettivi e percorsi critici per l'agente causale della tubercolosi, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)e cercare nuove sostanze chimiche che potrebbero diventare farmaci per la tubercolosi. Un approccio è quello di mettere a punto metodi adatti agli schermi genetici e chimici delle biblioteche su larga scala che consentano la ricerca di un ago in un pagliaio. A tal fine, abbiamo sviluppato un saggio fenotipico basato sul rilevamento di Mtb etichettate fluorescentmente all'interno di cellule ospiti etichettate fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata. Questo saggio in vitro consente una quantificazione basata sull'immagine del processo di colonizzazione della Mtb nell'ospite ed è stato ottimizzato per il formato micropiatta 384-well, che è corretto per schermi di siRNA-, composto chimico- o mtb mutante-librerie. Le immagini vengono quindi elaborate per l'analisi multiparametrica, che fornisce l'inferenza di lettura sulla patogenesi della Mtb all'interno delle cellule ospiti.
Introduzione
Tra gli agenti patogeni infettivi emergenti e riemergendo segnalati negli ultimi anni, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) occupa un posto di primo piano essendo responsabile di 1,4 milioni di morti e 8,7 milioni di nuove infezioni nel 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Nonostante la disponibilità di terapie multifarmaco, il numero di persone infette è ancora in aumento e la mtb multifarmaco resistente (MDR) e ampiamente resistente ai farmaci (XDR) si sta rapidamente diffondendo in tutto ilmondo 1. Inoltre, quando si prende in considerazione la presenza di antigeni mtb, è evidente ch....
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Protocollo
1. Screening del siRNA a livello genomico ad alta produttività
Screening eseguito in una linea cellulare umana di pneumociti di tipo II modello A549 in caso di infezione da Mtb H37Rv che esprime proteine fluorescenti verdi (GFP). Questa procedura è descritta nella figura 1A.
- Rimostrare la libreria di siRNA essiccata che viene conservata in piastre madre (piastre a 96 pozzoli) con tampone di siRNA 1x per raggiungere una concentrazione di 4 μM, quindi trasferire 10 μl della miscela in una piastra figlia di 384 po '(piastra figlia 1).
- Aggiungere 10 μl di tampone di siRNA 1x nella piastra figlia 1 per diluir....
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Risultati
Screening del siRNA a livello genomico ad alta produttività
Mtb è in grado di colonizzare le cellule immunitarie in vitro così come molte altre cellule epiteliali polmonari. Ad esempio, Mtb èin grado di infettare e danneggiare le cellule epiteliali A549 che sono comunemente utilizzate come modello per gli pneumociti di tipo IIumano 5-7. La dectina-1 è stata segnalata come recettore delle cellule ospiti coinvolto nell'assorbimento della mtb, nella ris.......
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Discussione
Descriviamo qui i metodi necessari per un saggio fenotipico utilizzando un ceppo Mtb H37Rv che esprime GFP per infettare le cellule ospiti etichettate fluorescentmente, il che lo rende appropriato per schermi ad alto contenuto / ad alta produttività. Questo protocollo potrebbe essere applicato a una vasta gamma di composti, sonde fluorescenti e mutanti Mtb. Per ogni protocollo sopra descritto, è possibile eseguire passaggi di fissazione e immunoetichettatura prima dell'acquisizione dell'immagine. Utiliz.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Il sostegno finanziario a questo lavoro è stato fornito dalla Comunità europea (sovvenzione ERC-STG INTRACELLTB n° 260901, sovvenzione MM4TB n° 260872), dall'Agence Nationale de Recherche, dalla Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) e dalla regione Nord Pas de Calais. Riconosciamo con gratitudine l'assistenza tecnica di Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni e Frank Lafont dalla piattaforma BICeL.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| µ piastra trasparente nera, 384 pozzetti | Greiner Bio-One | 781091 | 127,8/86/15 MM con coperchio, CellCarrier trattato TC |
| Piastra a 384 pozzetti | PerkinElmer | 6007550 | nero, fondo trasparente, con coperchio, fondo a V trattato TC |
| bianco, piastra a 384 pozzetti | Greiner Bio-One | 781280 | |
| nastro sigillante, traspirante, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamina RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Reagente di trasfezione |
| Dimetilsolfossido | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Terreno di coltura cellulare |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco' s Tampone fosfato salin |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco' s Fosfato Salin Buffer |
| Fetale siero bovino | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll per la purificazione periferica delle cellule dei monociti |
| CD14 MicroBeads, | Miltenyi | 130-050-201 | Purificazione dei monociti CD14+ |
| M-CSF umano, premium gr. (1000 μ g) | Miltenyi | 130-096-493 | fattore stimolante le colonie di macrofagi |
| Miltenyi | 130-042-401 | per l'isolamento di monociti CD14+ | |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Coltura di micobatteri |
| Glicerolo ad alta purezza | Euromedex | 50405-EX | Coltura di micobatteri |
| Arricchimento OADC Middlebrook | Becton-Dickinson | 211886 | Coltura di micobatteri |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Coltura di micobatteri |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Colorante per nuclei |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Colorante per nuclei |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Colorante nuclei/citoplasma |
| Formalina | Sigma-Aldrich | HT5014 | Soluzione di fissazione cellulare |
| siRNA mirato alla Dectina-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Pool di siRNA non mirato | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicina | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotico |
| Isoniazide (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotico |
| Igromicina B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotico |
| Amikacina | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotico |
| Microscopio confocale automatizzato OPERA | PerkinElmer | Acquisizione di immagini | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Trasferimento, archiviazione e analisi dei dati | |
| Software Acapella 2.6 | PerkinElmer | Analisi basata su immagini | |
| Software GraphPad Prism5 | GraphPad | Analisi statistica | |
| Excel 2010 | Microsoft | Analisi statistica |
Riferimenti
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of l....
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