本文介绍了一种基于活细胞荧光蛋白的方法，用于标记含有Chlamydia的细胞液泡（包涵体）。该策略可实现对样品中Chlamydia感染性的快速、自动化测定，并可用于定量研究包涵体的生长动态。
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本文内容
摘要
摘要
专性胞内细菌 沙眼衣原体 对全球公共卫生构成了巨大负担。 C. 沙眼衣原体 是导致性传播感染的主要细菌性病原体，也是全球可预防性失明的首要原因。沙眼衣原体成功感染宿主细胞的一个关键决定因素，是其在一种称为包涵体（inclusion）的新型空泡样区室内操控宿主细胞信号通路的能力。在包涵体内，沙眼衣原体获取其2-3天发育生长所需的营养物质，并且还会向空泡膜的胞质面以及宿主细胞质中分泌一系列效应蛋白。然而，目前对沙眼衣原体生物学特性的认知仍存在空白，这为观察和分析这一胞内区室带来了重大挑战。最近，已有研究描述了一种利用表达GFP的宿主细胞进行反向成像以可视化包涵体的策略。该方法合理地利用了包涵体膜对GFP等大分子物质固有的不通透性。在本研究中，我们阐述了如何构建表达GFP或mCherry的宿主细胞，以实现对衣原体包涵体的后续可视化观察。此外，该方法被证明可有效替代成本较高的基于抗体的计数方法，并可与其他荧光标记（如表达GFP的标记物）联合使用 沙眼衣原体，并可被用于从多种来源获取关于包涵体膜生长的关键定量数据 沙眼衣原体 物种与菌株
引言
由胞内细菌属物种引起的传染病 沙眼衣原体 对全球健康造成重大负担，包括性传播疾病、盆腔炎、失明、肺炎，以及可能的动脉粥样硬化1-4. 该能力 沙眼衣原体 在空泡（称为包涵体）内与宿主细胞相互作用，是衣原体成功感染细胞及宿主的关键决定因素。包涵体是一种新型的致病性区室，可支持衣原体的生长，并在整个2–3天的发育周期中动态改变 沙眼衣原体5. 衣原体的专性细胞内寄生特性给科研界带来了诸多挑战，尤其是在直接研究包涵体独特生物学特性方面。主要障碍之一是无法高效地对细胞内 沙眼衣原体 或通过荧光方法将其引入活细胞。最近的一项发现终于揭示了生成表达GFP的 C. trachomatis6；然而，这一发现尚未实现对包涵体的特异性标记。已有若干技术被用于细菌和包涵体的标记7,8，但这些方法存在非特异性、瞬时性以及易发生光漂白等缺点。我们课题组的一项重要发现是，利用表达GFP的宿主细胞建立了一种标记包涵体的新策略9该策略合理地利用了包涵体膜对分子量大于520 Da的分子具有内在不可渗透性的特性。10当细胞被改造为稳定表达某种胞质荧光蛋白时（例如，GFP 或 mCherry）， 沙眼衣原体 包涵体由于完全排除荧光，呈现出极为清晰的可见性。这种反向成像策略可实现对所有包涵体的即时可视化 沙眼....
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方案
1. 荧光宿主细胞系的构建
- 第1天。将293T细胞（或其他逆转录病毒包装细胞系）以每孔2 × 106个细胞的密度接种于6孔板中，使细胞在次日达到约75%融合度。如需要，可为每种逆转录病毒设置重复孔。
- 第2天。吸除培养基，每孔加入2 ml新鲜生长培养基（DMEM + 10% FBS + 2 mM L-谷氨酰胺）。使用Lipofectamine 2000或类似转染试剂，按照制造商说明，将5–8 µg逆转录病毒载体（含GFP）和包装载体（例如，pVSVg）共转染入细胞。
- 在37 °C CO2培养箱中将细胞与DNA共孵育4–6小时，随后更换为1 ml生长培养基。
- 在37 °C CO2培养箱中继续孵育细胞48小时。
- 第3天。将靶细胞（例如，HeLa细胞）以约105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，使细胞在次日达到约50%融合度。通过倒置显微镜观察GFP荧光，确认293T细胞转染成功。
- 第4天。用移液器收集293T细胞的含病毒上清液，并通过0.45 µm醋酸纤维素注射器滤器过滤上清液。
- 吸除HeLa细胞的培养基，加入含16 µg/ml聚凝胺的0.5 ml生长培养基。将约0.5 ml过滤后的病毒液逐滴加入细胞中，在37 °C CO2培养箱中孵育24小时....
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结果
表达胞质荧光蛋白（例如，GFP）的哺乳动物细胞可经基因工程改造，用于在活体感染细胞培养物中显示Chlamydia包涵体。感染Chlamydia后，包涵体在宿主细胞中清晰可见，表现为黑色斑点（图1）。缺乏荧光的包涵体具有明显对比度，可被用于在大量视野和/或不同处理条件下自动识别包涵体（图1）。一旦获得表达荧光蛋白的宿主细胞，即可建立一种强大的新工作流程，用于对实验样本中Chlamydia感染水平进行快速、定量分析。其中一个重要应用是测定活感染细胞中的Chlamydia包涵体形成单位（IFU）（图2）。该实验策略避免了领域内常规使用的免疫荧光染色步骤，后者既耗时又昂贵。
所述成像方法的另一个关键特征是，它可轻松应用于任何Chlamydia物种或菌株，并且还可用于推导沙眼衣原体包涵体的重要生物学特性。例如，对感染了C. trachomatis LGV血清型L2、C. tra.......
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讨论
在此，我们描述了用于生成荧光宿主细胞的实验策略，以实现对活细胞中生物学过程的实时可视化与分析 沙眼衣原体 包涵体。这种液泡可视化方法能够强有力地揭示、追踪并定量测量衣原体包涵体在细胞群体中或随时间推移在单个细胞中的动态特性。 沙眼衣原体 荧光蛋白标记细胞中的包涵体轮廓清晰，无需额外的免疫荧光处理即可轻松识别。此外，该方法的灵敏度足以分辨出不同特征性的形态学差异 沙眼衣原体 物种和菌株所具有的特征，例如每细胞空泡数量和包涵体曲率。此外，我们展示了如何调整成像软件以自动识别表达GFP的宿主细胞中的包涵体。无需进行免疫荧光标记步骤即可显示沙眼衣原体包涵体，从而在终点检测（如包涵体形成单位（IFU）测定）中为使用者节省大量时间和成本。 Furthermore，能够在活细胞中成像包涵体，使得同一群体的感染细胞可在沙眼衣原体发育周期的精确时间点被反复分析，从而减少了时间进程研究所需的孔板数量。细胞质GFP、mCherry， 等等。，产生明亮且稳定的信号，不会发生光漂白；这一特性对于长时间的延时成像实验至关重要。最后，由于该技术不依赖于 沙眼衣原体 发育基因表达.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
作者感谢 Ian Clarke 和 P. Scott Hefty 分别提供了质粒 pGFP-SW2 和 pASK-GFP-mKate2-L2。我们感谢 Paul Miller 提供的技术支持以及 Richard Stephens 提供的其他资源。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI095603（KH）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm 过滤器 | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| 不含酚红的 RPMI 1640 | Cellgro | 17-105-CV | |
| 青霉素 G | Sigma | 13752 | |
| 放线菌酮 | Sigma | C7698 | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 腔室载玻片，Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
参考文献
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
- Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , A....
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