PCR combinada com a análise de fusão de alta resolução (HRMA) é demonstrado como um método rápido e eficiente para a genotipagem de peixe-zebra.
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Artigo de método
Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt
Neste artigo
Resumo
Resumo
Zebrafish é um poderoso sistema modelo para o estudo de vertebrados desenvolvimento, modelagem de doenças, e realizar a triagem de drogas. Recentemente, uma variedade de ferramentas genéticas foram introduzidas, incluindo várias estratégias para induzir mutações e gerar linhagens transgênicas. No entanto, o rastreio em larga escala é limitada pelos métodos de genotipagem tradicionais, que são consumidoras de tempo e de trabalho intensivo. Aqui nós descrevemos uma técnica para analisar genótipos zebrafish por PCR combinada com análise de alta resolução de fusão (HRMA). Esta abordagem é rápida, sensível e de baixo custo, com menor risco de artefatos de contaminação. A genotipagem por PCR com HRMA pode ser usado para embriões e peixes adultos, incluindo protocolos de triagem de alto rendimento.
Introdução
Peixe-zebra (Danio rerio) é um sistema de modelo animal vertebrado amplamente utilizado para estudos de desenvolvimento e modelagem de doenças. Recentemente, várias tecnologias transgênicas e mutação foram desenvolvidos para zebrafish. Técnicas de transgenia rápidos, geralmente com base em um sistema de transposon Tol2 1, foram combinados com melhores opções de clonagem para uma montagem múltipla fragmento de DNA 2. Nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e de transcrição nucleases efectoras activadores do tipo (TALENS) têm sido utilizadas para direccionar loci em ambas as células somáticas e germinais em peixes-zebra 3,4. Estas t....
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Protocolo
1. Preparação de DNA
- Preparar tampão de lise de ADN: 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Adicionar fresco proteinase K para uma concentração final de 1 mg / mL, no dia da utilização 12.
- Coleção de tecidos:
- Para o adulto clipe fin fish:
- Anestesiar peixe: Coloque o peixe em 0,004% solução (tricaina) MS-222. Espere até que o movimento de emalhar diminui.
- Coloque os peixes em uma pilha de 5-10 Kimwipes e cortar um pequeno pedaço da barbatana caudal, cerca de 2-3 mm, com uma lâmina de barbear estéril.
- Colocar rapidamente o peixe em um tanque rotulado com água fresca para....
- Para o adulto clipe fin fish:
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Resultados
O protocolo pode ser realizada durante um único dia ou separada em passos ao longo de vários dias (diagrama de fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1). Extracção de ADN é seguida pela análise de fusão e de produtos de amplificação de PCR. As temperaturas para a fusão do fragmento amplificado dependerá do tamanho e conteúdo GC, mas geralmente iniciar e as temperaturas finais de 50 ˚ C e 95 ˚ C são adequados (Figuras 2A e 2B). Uma vez que a fusão é realizada, a análise .......
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Discussão
PCR combinada com HRMA é uma tecnologia poderosa para a genotipagem do peixe-zebra. As vantagens desta abordagem são a sua velocidade, robustez, e a sensibilidade para detectar mesmo mutações pontuais. O protocolo de todo, a partir de aleta-grampo análise para derreter-curva, pode ser realizada em menos de oito horas, por um único indivíduo. Além disso, a técnica é tratável através de rastreio de alto rendimento; não requer a utilização de brometo de etídio, e é selada por todas as etapas de PCR e de análise, que ajuda .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a membros das Blaschke, Grunwald, e Wittwer laboratórios para aconselhamento e assistência técnica. Este trabalho é apoiado pela Fundação PCMC, NIH R01 MH092256 e DP2 MH100008, ea Marcha de Dimes Foundation bolsa de investigação # 1-FY13-425, a JLB.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96 poços BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| Software LightScanner com Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Análise de fusão de alta resolução 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software de design de primer | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldeído |
Referências
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al.
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Reimpressões e permissões
