Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus menschlichem Urin unter Verwendung einer modifizierten Fällungstechnik.

Zusammenfassung

Die Identifizierung von Biomarkern, die eine frühzeitige Erkennung von Nierenerkrankungen im Urin und Plasma ermöglichen, ist seit mehreren Jahren ein Bereich von aktivem Interesse. Exosomenvesikel im Urin, 40-100 nm groß, werden unter normalen Bedingungen von Zellen aus allen Nephronsegmenten in den Urin abgegeben und können Proteine, mRNA und microRNA enthalten, die für ihren Zelltyp repräsentativ sind. Bei Nierenfunktionsstörungen oder -verletzungen können Exosomen veränderte Anteile dieser Komponenten enthalten, die als Biomarker für Krankheiten dienen können. Derzeit stehen mehrere Methoden zur Isolierung von Exosomen im Urin zur Verfügung, und wir haben zuvor einen experimentellen Vergleich jedes dieser Ansätze durchgeführt, darunter drei auf Ultrazentrifugation, einen mit einem Nanomembran-Ultrafiltrationskonzentrator, einen mit einem kommerziellen Fällungsreagenz und eine mit einer Modifikation der Fällungstechnik unter Verwendung des ExoQuick-Reagenzes, das wir in unserem Labor entwickelt haben. Wir fanden heraus, dass die modifizierte Fällungsmethode die höchste Ausbeute an Exosomenpartikeln, miRNA und mRNA erzeugte, so dass dieser Ansatz für die Isolierung von Exosomen für die anschließende RNA-Profilierung geeignet ist. Wir kommen zu dem Schluss, dass die modifizierte Exosomenfällungsmethode eine schnelle, skalierbare und effektive Alternative für die Isolierung von Exosomen aus dem Urin bietet. In diesem Bericht beschreiben wir unsere modifizierte Fällungstechnik mit ExoQuick-Reagenz zur Isolierung von Exosomen aus menschlichem Urin.

Einleitung

Urinary Exosomen sind kleine interne Bläschen von 100 nm von multivesicular bodies (MVB) von allen Zelltypen unter normalen und pathologischen Bedingungen in Urin-Raum einschließlich der glomerulären Podozyten, Nierentubuluszellen und Zellen entlang der Urindrainage-Systeme, die für die miRNAs ¹ angereichert werden angezeigt abgeleitet ^-2. Viele Forscher haben unterschiedliche Proteine ​​in Exosomen aus dem Urin von gesunden Personen als auch solche mit eingeschränkter Nieren- und / oder systematische Erkrankungen ^3-5 getrennt erfasst. Exosomen kann unter Verwendung verschiedener Verfahren, wie zweistufige Differential Ultrazentrifuga....

Protokoll

. Hinweis: Der in der Isolierung der Exosomen Harn unter Verwendung der modifizierten Fällungsverfahren beteiligten Schritte sind in der Figur 1 dargestellten anfänglichen Schritte beinhalten die Entfernung von großen toten Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation. Das endgültige Pellet aus der aus jedem nachfolgenden Schritt gesammelten Überstand erhalten entspricht der Exosomen, die in Isolationslösung für die weitere Gewinnung von Protein, RNA und DNA, gelöst wird.

1. Sammlung von Urin

1. Vor der Urinsammlung, bereiten Protease-Inhibitor-Cocktail nach den Anweisungen des Herstellers und fügen 3,125 ml dieser....

Ergebnisse

Urinary Exosomen tragen Protein, miRNA und mRNA-Biomarker von Nierenepithelzellen abgesondert. Die Isolierung und Detektion dieser Exosomen kann ein nützliches Diagnosewerkzeug zur Früherkennung von Nierenkrankheiten bereitzustellen, wie diabetische Nephropathie. Es gibt verschiedene Verfahren zur Isolierung von Exosomen aus Urinproben von menschlichen Probanden gesammelt. Wir haben vorher gegen sechs Methoden der Urin Exosom Isolation und untersucht resultierende Protein, mRNA und miRNA Ebenen ^11. Unser Ziel.......

Diskussion

Die meisten Verfahren, die Ausfällung der Exosomen aus Urin adressieren nicht die Entfernung des polymeren Netzwerks von Tamm-Horsfall-Protein (THP) gebildet. Dieses Protein ist in großen Mengen im Urin, wo sie mutmaßlich Fallen Exosomen während der anfänglichen Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit vorhanden ist. In unserem modifizierten Methode reduzierten wir THP mit DTT vor Exosom Niederschlag. Wie in Figur 2 gezeigt, wurde eine größere Menge von THP in unverändertem Urin und Pellet beobachte.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Corning 15 ml Zentrifugenröhrchen	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Proteaseinhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P8340
Zentrifuge	Sorvall
DL-Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	verwendet in einer Endkonzentration von 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE System (4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10 Wells	Invitrogen	NP0321BOX	Für die SDS-PAGE-Analyse
ECL Advance Western Blot Detection Kit	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	Für den Western Blot Nachweis von Biomarkern
Exoquick-TC Reagent	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	Für die Exosomenisolierung
Exosom CD9 ELISA Complete Kit	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	Für die Exosomenquantifizierung
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini-Kit	Qiagen	80004	Für die Isolierung von DNA, RNA und Proteinen
Rneasy MinElute Cleanup Kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Spektralphotometer	Thermo Scientific		Für die Proteinquantifizierung
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	Zum Färben von SDS-PAGE Gelen
Xcell SureLock Mini-Zellelektrophorese-System	Life Technologies		Für die Ausführung der SDS-PAGE-Gele
TaqMan microRNA-Assays	Life Technologies		Für RT-PCR-Assays
qBasePlus v1.5 Software	Biogazelle NV		Für die Analyse von RT-PCR-Assay-Daten
Polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen ALIX	Millipore		Für den Western-Blot-Nachweis von Biomarkern
Monoklonaler Maus-Antikörper gegen TSG101	Abcam		Für den Western-Blot-Nachweis von Biomarkern