العزلة والكمي لالبوتولينوم السموم العصبية من مصفوفات مجمع باستخدام مصفوفة BoTest فحوصات

ملخص

البوتولينوم عصبي BoTest ماتريكس (بونت) فحوصات الكشف تنقية بسرعة وتحديد بونت من مجموعة من المصفوفات العينة. هنا، نقدم بروتوكول للكشف والقياس الكمي للبونت من المصفوفات سواء الصلبة والسائلة وإظهار مقايسة مع البوتوكس، والطماطم، والحليب.

الملخص

مطلوب كشف دقيق وتقدير حجم عصبي البوتولينوم (بونت) في مصفوفات معقدة للأدوية، والبيئية، واختبار عينة الغذاء. مطلوب السريع بونت اختبار المواد الغذائية خلال الطب الشرعي الفاشية، تشخيص المريض، واختبار سلامة الأغذية في حين أن المطلوب دقيقة اختبار فاعلية لتصنيع المنتجات القائمة على المخدرات بونت وسلامة المرضى. الأحيائي الماوس تستخدم على نطاق واسع لاختبار بونت هي حساسة للغاية لكنه يفتقر الى الدقة والإنتاجية اللازمة لاختبار بونت السريع والروتينية. وعلاوة على ذلك، أدى استخدام الأحيائي في الحيوانات في المكالمات من قبل السلطات التنظيمية المنتج المخدرات وأنصار حقوق الحيوان في الولايات المتحدة والخارج ليحل محل الماوس الأحيائي لاختبار بونت. وقد وضعت عدة فحوصات في المختبر الغيار التي تعمل بشكل جيد مع تنقيته بونت في مخازن بسيطة، ولكن لم يظهر معظم لتكون قابلة للتطبيق لاختبار المصفوفات في معقدة للغاية. هنا، وبروتوكول للكشف عنويرد في مصفوفات معقدة بونت باستخدام مصفوفة BoTest المقايسات. يتكون الاختبار من ثلاثة أجزاء: الجزء الأول يشمل إعداد العينات للاختبار، والجزء الثاني هو خطوة مناعي استخدام الألغام المضادة للبونت المغلفة الأضداد الخرز ممغطس لتنقية بونت من المصفوفة، والجزء الثالث الكمي بروتين المعزول بونت ل النشاط باستخدام مراسل الفلورة. يتم كتابة بروتوكول للاختبار إنتاجية عالية في لوحات 96 جيدا باستخدام المصفوفات سواء السائلة والصلبة ويتطلب حوالي 2 ساعة إعداد دليل بإجمالي مرات الفحص من 4-26 ساعة اعتمادا على نوع العينة، تحميل السم، وحساسية المطلوب. يتم عرض البيانات لبونت / A الاختبار مع الفوسفات مخزنة المالحة، وهو منتج المخدرات، والثقافة طاف والحليب 2٪، والطماطم الطازجة ويتضمن مناقشة المعايير الضرورية للنجاح الفحص.

المقدمة

أعصاب البوتولينوم (BoNTs) هي المواد المعروفة فتكا، بجرعات قاتلة الإنسان في الوريد تقدر ب 1-3 نانوغرام / كغ ^1،2. سبعة الأنماط المصلية مماثلة هيكليا من بونت، وصفت من A إلى G، موجودة، يتألف كل منها من سلسلة مجال الثقيلة مسؤولة عن خلية ملزمة، امتصاص، وإزفاء في العصارة الخلوية وسلسلة الضوء الذي يشفر ببتيداز داخلية الزنك ^3-5. سمية رائعة من بونت النتائج من، في جزء منه، دخولها ملزمة ومحددة في الخلايا العصبية الحركية عند تقاطع العصبية والعضلية ^6. مرة واحدة داخل الخلايا العصبية، وعلى وجه التحديد ببتيداز داخلية سلسلة ضوء يشق واحد أو أكثر من ذوبان N-تراعي ethylmaleimide البروتين عامل مرفق مستقبلات ....

البروتوكول

1. إعداد الفحص الكواشف

1. ذوبان الجليد dithiothreitol 200X (DTT)، 10X ماتريكس تجليد العازلة (10X العازلة ملزم الآخرة)، 10X تحييد العازلة (عينات غير متوازن الطعام أو درجة الحموضة فقط)، و 10x BoTest رد فعل العازلة (10X العازلة رد فعل الآخرة) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة أو حتى تحسنت تماما. انظر الجدول رقم 1 للحصول على قائمة من مخازن والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول. انظر الجدول رقم 2 للحصول على قائمة من المواد والمعدات اللازمة لهذا البروتوكول.
2. دو....

النتائج

ويظهر رسم تخطيطي يلخص الخطوات في البروتوكول هو موضح في الشكل 2. مقايسة بين 4-26 ساعة يتطلب لاستكمال اعتمادا على نوع العينة وحساسية الفحص المطلوب، ولكن فقط ~ 2 ساعة من التدريب العملي في الوقت المحدد. يتم إجراء الفحص في لوحات 96 جيدا، واعتمادا على نوع من التجارب التي يتم تنفيذها، ويسمح الاختبار ثلاث نسخ تصل إلى 20 عينة بما في ذلك المعايير لكل لوحة.

ويبين الشكل 3 نتائج الفحص باستخدا.......

المناقشة

يصف هذا البروتوكول إجراءات لقياس بونت / مجمع، holotoxin، أو كلوستريديوم الثقافة طاف في مصفوفات معقدة. البروتوكول هو نفسه، ومع ذلك، عند اختبار الأنماط المصلية الأخرى بونت (بونت مثل / B، E، F و) مع المقايسات الخاصة ماتريكس منها ^56،60، على الرغم من حساسية الفحص سوف تختلف باختلاف الأنماط المصلية والمقايسات. لا يأخذ في الحسبان هذا البروتوكول لكل نوع من عينة ممكن ان يكون قد يتطلب بعض التعديلات تبعا لتكوين عينة محددة والتطبيق المطلوب. ويمكن أن تشمل مصفوفات ال.......

المواد

تتوفر أيضا جهاز مداري ينبغي معالجة ألواح ذات 96 بئرا ، شريط ختم

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مجموعة أدوات الكشف عن السموم العصبية BoTest Matrix A	BioSentinel	A1015	ل BoNT / B و F.
قارئ الألواح الدقيقة الفلورية Varioskan	Flash Thermo Fisher Scientific	5250040	يمكن استخدام معظم الوحدات أحادية اللون أو المرشح مع إثارة 434 نانومتر وقدرة انبعاث 470 نانومتر و 526 نانومتر.
96-جيدا لوحة فصل الخرزة المغناطيسية	V & P Scientific	VP771H	يمكن استخدام ألواح مغناطيسية أخرى ، ولكن يجب تصميم اللوحة لفصل الخرزات إلى جانب البئر.
غسالة الألواح المتوافقة مع الخرزة المغناطيسية	BioTek	ELx405 VSRM	اختيارية ، مطلوبة فقط لغسل الألواح الآلي. يمكن أيضا استخدام غسالات الألواح الأخرى المتوافقة مع الخرزة المغناطيسية ، ولكن يجب اختبارها قبل الاستخدام.
		الطرد المركزي الدقيق	اختياري ، مطلوب فقط للعينات التي تحتاج إلى الطرد المركزي.
خلاط الألواح MixMate	Eppendorf	22674200
شاكر			يستخدم في درجة حرارة الغرفة أو عند 25 درجة ؛ C إذا كان التحكم في درجة الحرارة متاحا
، فإن أقراص مثبطات البروتياز الخالية من EDTA ،	فإن Roche 4693132001		مطلوبة فقط للطعام أو الاختبارات البيئية. يجب أن تكون مثبطات الإنزيم البروتيني خالية من EDTA.
BoNT / A	Metabiologics		اختياري ، مطلوب فقط لأغراض التوحيد القياسي والقياس الكمي
الأسود ، لا	NUNC	237105
القاع المسطح	الألواح الحرارية فيشر العلمي	15036