Bakteri hücre duvarı peptidoglikan, peptitler tarafından çaprazlanmış şeker iplikçiklerinden oluşan bir makromoleküler ağdır. Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi, peptidoglikan kompozisyonunun yeni keşifleri için yüksek çözünürlük ve verim sağlar. Hücre duvarlarının izolasyonu (sakculi) ve daha sonra UPLC aracılığıyla analize hazırlanmaları için bir prosedür sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Bakteri hücre duvarı, büyüme ve bölünme sırasında hücre şeklinin belirlenmesi için kritik öneme sahiptir ve turgor basınçları karşısında hücrelerin mekanik bütünlüğünü korur. Bakteri krallığının çeşitli şekil ve boyutlarında, hücre duvarı kısa peptitlerle birbirine bağlanmış bir makromoleküler şeker iplikçik ağı olan peptidoglikan'dan oluşur. Peptidoglikanın bakteriyel fizyolojiye verdiği merkezi önem, antibiyotik hedefi olarak kullanılmasının altındadır ve büyüme ve bölünme sırasında nasıl sağlam bir şekilde bir araya getirildiğine dair genetik, yapısal ve hücre biyolojik çalışmalarını motive etmektedir. Bununla birlikte, peptidoglikan sentezindeki temel enzimatik faaliyetleri ve bakteri hücre duvarlarının kimyasal bileşimini tam olarak karakterize etmek için hala kapsamlı araştırmalar yapılması gerekmektedir. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC), çeşitli çevresel ve genetik koşullar altında yetişen bakterilerin duvarlarının kimyasal bileşimindeki farklılıkları ölçmek için güçlü bir analitik yöntemdir, ancak verimi genellikle sınırlıdır. Burada, HPLC ve Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC) aracılığıyla peptidoglikan'ın biyolojik analizleri için bakteri hücre duvarlarının izolasyonu ve hazırlanması için basit bir prosedür sunuyoruz, HPLC için 6.000 psi ile karşılaştırıldığında, 15.000 psi'ye kadar ultra yüksek basınç sağlamak için pompaları kullanan HPLC'nin bir uzantısı. Burada sunulan bakteri hücre duvarlarının hazırlanmasıyla birlikte, düşük hacimli numune enjektörleri, yüksek örnekleme oranlarına sahip dedektörler, daha küçük numune hacimleri ve UPLC'nin daha kısa çalışma süreleri, ultrasantrifüje ve UPLC'ye erişimi olan çoğu biyolojik laboratuvarda peptidoglikan bileşiminin ve temel bakteri hücre biyolojisinin yeni keşifleri için yüksek çözünürlük ve verim sağlayacaktır.
Giriş
Burada açıklanan yöntemin amacı, bozulmamış bakteri hücre duvarlarını (sakculi) izole etmek ve peptidoglikan'ı (PG) sindirmektir, böylece Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC), muropeptid bileşenlerinin kimliği ve konsantrasyonları, glikan iplikçiklerinin ortalama uzunluğu ve iplikçikler arasındaki çapraz bağlantılarda yer alan malzemenin fraksiyonu gibi bilgileri sağlamak için kullanılabilir. PG biyokimyası ve muropeptid türlerinin ayrıntılı bir tartışması için, PG yapısını ve enfeksiyon, direnç, morfogenez ve büyümedeki rolünü açıklayan birkaç mükemmel inceleme vardır1-6. PG analizi için Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ilk olarak 19....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Bir Gecede 2,5 ml Medyada Bakteri Kültürleri Yetiştirin
Kültürleri 1:100'den 250 ml taze ortama geri seyreltin ve0.7-0.8'in 600'üne kadar büyüyün. Suda% 6 sodyum dodecyl sülfat (SDS) çözeltisi hazırlayın.
DİkKAT: SDS tozu tehlikelidir - SDS tozunu solumaktan kaçının; burun ve ağız üzerine maske takın.
2. Gün 1 - Lysing Bakteri Kültürleri Bir Gün ve Gece Boyunca Gerçekleştirilir
- Seyreltilmiş kültürler büyürken, 1 L beherde sıcak bir tabağa kaynar su banyosu kurun. Su kaynadıktan sonra, 50 ml polipropilen tüplere 6 ml%6 SDS aliquot, her tüpe bir küçük karıştırma çub....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1'deözetlenen yordamı kullanarak, son örnek doğrudan bir UPLC şişesine filtrelenmiş en az 200 μl net çözeltiden oluşmalıdır (adım 4.4). Bakteriyel bir numunedeki çeşitli muropeptitlerin UPLC ayrımı, sıvı mobil faz ile sütunun sabit fazı arasındaki göreceli çözünürlüklerine dayanır. Ters fazlı C18 sütunları, hidrofobiklik ve boyut8'egöre muropeptid türlerini ayırmak için güçlü bir hidrofobik matris sağlar; polar, düşük moleküler ağırlıklı monomerler önce elute ve apoler, daha yüksek molek.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu prosedürde kritik bir adım, numune hazırlamanın ikinci gününün 3.1. SDS bir gecede çöktüyse veya numuneler oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca% 4 SDS'de saklanmışsa, SDS'yi yeniden analiz etmek için numuneler en az 1 saat boyunca yeniden ayrılmalıdır. SDS yağışının yaygın bir nedeni potasyum tuzları olan ortamın kullanılmasıdır, bu nedenle mümkünse medyada potasyumdan kaçınılmalıdır. Temsili Sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi, pH'ı muropeptidlerin izoelektrik noktasına (~3.5) ayarlamak da önemlidir, ancak pH 3'ten.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bu makalenin üretim maliyetleri Waters Corporation tarafından desteklenmiştir.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH Director'un Yeni Yenilikçi Ödülü DP2OD006466 (K.C.H.'ye) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Russell Monds'a yöntemin pratik bir gösterimi ve bilimsel tartışmalar için teşekkür ediyor.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901'den | |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolizin Sodyum borohidrür (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodyum borhidrür, Ortofosforik asidin işlenmesi oldukça reaktif ve tehlikelidir |
| ; | Sigma-Aldrich | 79607 | Ortofosforik asit aşındırıcıdır ve kullanımı tehlikelidir |
| Borik asit | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodyum azit | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodyum azit bir zehirdir |
| Sodyum tetraborat | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μ m şırınga filtreleri | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH şeritleri (pH aralığı 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polipropilen Falcon tüpleri | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm cam tüpler | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm vidalı boyunlu cam geri kazanım şişesi | Sular | 186000327C | |
| Sodyum Dodesil Sülfat | Ambion | AM9820 | SDS tozu tehlikelidir |
| Enstrümantasyon | |||
| Suları Temin UPLC H-Sınıfı sistem, dahil: | |||
| Doğruluk UPLC H-Sınıfı Numune Yöneticisi FTN | |||
| Doğruluğu UPLC H-Sınıfı Kuaterner Solvent Yöneticisi | |||
| Doğruluk UPLC BEH C18 1.7 ve mikro; m sütun | |||
| Doğruluğu UPLC PDA Dedektörü | |||
| Su Fraksiyonu Kollektörü III | |||
| Doğruluk UPLC 30 cm Kolon Isıtıcı/Soğutucu |
Kaynaklar
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Bio....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
