利用粒子追踪微流变学对三维肿瘤模型中细胞外基质刚度进行纵向测量

摘要

粒子追踪微流变学可用于无损地定量分析并空间定位三维肿瘤模型中细胞外基质力学性质的变化。

摘要

机械微环境已被证实可作为调控肿瘤生长行为和信号转导的关键因素，其自身也在一系列复杂的双向力学敏感性相互作用过程中被重塑和改变。尽管具有生物学相关性的三维肿瘤模型的建立已促进了基质流变学对肿瘤生长影响的机制研究，但反向问题——即描绘肿瘤所诱导的机械微环境变化——仍然具有挑战性。本文描述了粒子追踪微流变学（PTM）与胰腺癌三维模型相结合的实施方法，作为一种可靠且可行的策略，用于长期监测肿瘤微环境中的物理变化。 原位. 此处所述的方法整合了一种制备系统 体外 嵌入I型胶原蛋白构建的模拟细胞外基质（ECM）支架中的三维模型，其内部均匀分布荧光标记探针，用于在整个样本中进行位置和时间依赖性的微流变学测量。 体外 肿瘤在多孔成像板中以平行条件进行铺板和检测。基于既定方法，通过广义斯托克斯-爱因斯坦关系（GSER）将示踪探针运动的视频转换为复频率依赖性黏弹性剪切模量。 G*ω由于该方法基于成像技术，机械特性可同时映射到大视野透射光空间区域，以同步报告三维肿瘤大小和表型的定性变化。文中展示了代表性结果，包括与局部侵袭诱导的基质降解相关的不同亚区域的力学响应对比，以及系统校准和验证数据。同时列出了常见实验错误导致的不良结果及相应的问题排查方法。本方案采用的96孔三维培养板格式，有利于将微流变学测量与药物筛选实验或分子成像相结合，从而深入理解治疗干预或生化刺激对肿瘤力学微环境的影响。

引言

越来越多的文献证据表明，癌细胞与非恶性哺乳动物上皮细胞一样，对机械环境具有高度敏感性 以及周围细胞外基质（ECM）和其他微环境组分的生物物理特性^1-9优雅的机制研究揭示了细胞外刚度作为复杂的力学敏感性信号伙伴在调控恶性生长行为和形态发生中的作用^2,3,10,11。这项工作尤其得益于三维技术的发展 体外 可恢复生物学相关组织结构的肿瘤模型，可在力学性能可调的支架材料中培养，并可通过光学显微镜成像^12-19然而，肿瘤与微环境之间这种机械调控对话的另一面——即癌细胞反过来改变其周围环境流变学特性的过程——研究起来仍较为困难。例如，在侵袭过程中，肿瘤边缘的细胞可能发生上皮-间质转化（EMT），并上调基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，从而导致细胞外基质（ECM）的局部降解^20-22，进而影响其他邻近肿瘤细胞的力学敏感性生长行为。通过多种生物化学过程，癌细胞会持续调节其周围微环境的局部刚度，以适应不同时期的各种生理需求。本文所述方法源于对分析工具的需求，这类工具能够报告细胞外基质（ECM）在细胞生长过程中局部刚度和顺应性的变化，可与三维肿瘤模型整合，并能在不终止培养的前提下，长期关联监测生化和表型的动态变化。

在寻找适用于此背景的合适技术时，粒子追踪微流变学（PTM）成为一个强有力的候选方法。该方法最初由 Mason 和 Weitz^23,24 开创，利....

方案

1. 肿瘤类球体的培养

1. 将10 ml细胞培养级水与0.1 g琼脂糖混合，制备成1%的琼脂糖溶液。
2. 将琼脂糖溶液加热至70 °C以上（在标准微波炉中加热约14秒 ，或使用加热板），然后取40 μl 琼脂糖溶液加入96孔板的一个孔中。
3. 将板在37 °C下孵育至少1小时，同时采用标准技术收集细胞。
4. 使用血细胞计数板测定细胞悬液中的细胞浓度。
5. 将细胞悬液稀释至1,000 个细胞/ml ，并取100 µl 该稀释液加入含有固化琼脂糖基质的孔中。
6. 将样品置于37 °C 、5% CO₂的培养箱中，在摇床上过夜培养。
7. 从摇床上取出样品，加入100 µl 细胞培养基。
8. 继续孵育类球体，直至达到所需直径。例如，培养9天后，类球体直径约为450 µm。在此期间，可向孔中补充新鲜培养基，但应避免吸液，以免导致类球体被移除。

2. 制备嵌入细胞外基质的三维肿瘤球

1. 在超净工作台内准备一个配备所需材料的工作站。
2. 通过将2份储备探针（2%固体含量）加入25份无菌水中，配制羧基化修饰的1 μm直径荧光示踪探针的稀释混合液。
3. 从冰箱中取出一瓶3.1 mg/ml 牛胶原蛋白，并置于冰上....

结果

为了验证在复杂的模型肿瘤微环境中特定位置测量 G*(ω) 的有效性，我们进行了两项初步验证实验。首先，我们将测量结果与体相振荡剪切流变学的“金标准”进行比对。我们制备了相同批次的胶原基质样品（不含细胞），胶原浓度为 1.0 mg/ml。这些样品分别使用体相流变仪（TA Instruments AR-G2，采用 40 mm 平行板夹具）和粒子跟踪微流变学（PTM）（使用与本方案中相同的参数）进行检测，并比较所得的 G'(ω) 和 G"(ω) 测量结果（图 2A）。两种方法的测量结果高度一致。其次，为了验证本方案检测细胞外基质（ECM）局部流变学变化的能力，我们制备了浓度为 1.0 mg/ml 的胶原基质并嵌入示踪微球。随后，对样品进行中心位置注射 5 μl dispase 酶（图 2B），该酶可快速降解胶原。在 37 °C 下孵育 3 小时以允许局部胶原降解发生后，我们在距注射点不同距离处采集视频数据，并分别测量各位置的 G'(ω) 和 G"(ω)。结果显示，在注射点处 G"(ω = 1 rad/sec) 的幅值大于 G'(ω = 1 rad/sec) .......

讨论

在本实验方案中，我们介绍了一种稳健且广泛应用的策略，用于在三维肿瘤模型中纵向追踪细胞外基质（ECM）刚度的局部变化。我们预计，该方法可被关注肿瘤生长和侵袭过程中与基质重塑相关的机械敏感性行为的癌症生物学家和生物物理学家所采用。对基质降解动力学进行精确量化，可能对研究基质金属蛋白酶、赖氨酰氧化酶或其他相关生化物质在三维肿瘤模型中活性的研究人员尤为有价值，这些物质直接参与基质重塑过程。除了本文所述的三维肿瘤模型应用外，还可设想将此方法与其他疾病模型系统结合使用，其中基质流变学随时间的变化发挥着重要作用^46,47。随着软件的不断改进，该方法的实用性持续提升，进一步实现了流程自动化，并支持高通量研究。这将能够在多孔板格式中，同时获得大量样本物理微环境的日益详尽的动态图像。

本文重点描述了在三维肿瘤模型中实施被动粒子示踪微流变学的方法，该方法适用于测量线性黏弹性响应，其模量范围约为数十帕斯卡，典型于市售的细胞外基质产品（如牛胶原蛋白、EHS肿瘤提取物或商用纳米纤维支架）。即使采用高数值孔径光学系统来量化微小探针位移，对随机的热驱动运动的观测本质上仍局限于这些相对较软的细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛I型胶原蛋白	BD 生物科学公司，美国加利福尼亚州圣何塞	354231
PANC-1	美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州马纳萨斯	CRL1469	或其他合适的细胞类型
荧光微球	Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德	906906
Matrigel	BD 生物科学，贝德福德，马萨诸塞州	354230
琼脂糖	Fisher Bioreagents，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents，马萨诸塞州沃尔瑟姆	NC0480985
96孔成像板	康宁股份有限公司，纽约州康宁市	3904
DMEM	Hyclone，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	SH30243.01	或适当的细胞培养基
蔡司 AxioObsever 显微镜	蔡司，德国奥伯科亨		包括高速摄像机和成像软件
MATLAB 软件	The Mathworks，美国马萨诸塞州纳蒂克