RNA聚合酶II合成的前体RNA会延伸至成熟mRNA的3'末端之外。成熟RNA的末端在转录过程中由RNA序列决定的位置通过切割复合物的核酸内切酶活性生成。本文详细描述了研究切割反应的方法 体外.
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
哺乳动物mRNA的3’端并非由RNA聚合酶II（RNPII）转录时突然终止形成。相反，RNPII会继续合成超出成熟RNA末端的前体mRNA，随后在特定位置通过内切核酸酶的活性进行切割。前体RNA的切割通常发生在保守多聚腺苷酸化位点（AAUAAA）下游10-30个核苷酸处，且紧随CA二核苷酸之后。切割复合物是一种多因子蛋白复合物，分子量约为800 kDa，其中的蛋白质负责执行这一特异性的核酸内切活性。多聚腺苷酸化位点上下游的特定RNA序列可调控切割复合物的募集。切割完成后，前体mRNA立即由多聚腺苷酸聚合酶（PAP）进行加尾，生成成熟的、稳定的RNA分子。
使用带有特异性放射性标记RNA底物的细胞核提取物，可对RNA转录本3’末端的加工过程进行研究。总之，一种长 32P标记的未切割前体RNA与核提取物孵育 体外，通过凝胶电泳和放射自显影评估切割情况。当发生正确切割时，可检测并定量较短的5’端切割产物。本文以HIV-1 mRNA的3’端加工为例，详细描述该切割实验方法。
引言
大多数成熟的真核生物信使RNA（mRNA）的生物合成需要多种转录后修饰，例如加帽、剪接和多聚腺苷酸化。这些修饰通常相互偶联，以确保正确的加工过程1，并显著提高mRNA的稳定性。
哺乳动物前体mRNA的3’端形成是通过内切核酸酶对新生RNA进行切割，随后由多聚腺苷酸聚合酶（PAP）在5’端切割产物上添加腺苷酸残基而实现的2-4。在哺乳动物中，切割过程由一个约800 kDa的多组分蛋白质复合物完成，该复合物在特定的前体RNA序列上组装。多聚腺苷酸信号序列是一个高度保守的经典六核苷酸序列AAUAAA，可指导切割位点位于其下游约10–30个核苷酸处。该位点被切割与多聚腺苷酸化特异性因子（CPSF）特异性识别，其中CPSF的73 kD亚基含有内切核酸酶活性。切割刺激因子（CstF）则结合于多聚腺苷酸位点下游一段更为多变的富含GU或U的序列元件。哺乳动物切割因子I（CFIm）和哺乳动物切割因子II（CFII）也是切割所必需的。CFIm结合于上游序列元件（USEs）中特定的UGUA(N)位点，这些位点已在多个基因中被鉴定，并似乎参与重要的生理过程5-8。
体外中，RNA 加工反应通常通过使用放射性标记的 RNA 底物进行分析9-12。这些底物可通过来自噬菌体 T7 或 SP6 启动子的加尾转录合成。在研究尚未表征的多聚腺苷酸化位点....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 贴壁细胞向悬浮状态的适应性转化
（此为可选步骤。悬浮细胞通常可制备出更好的核提取物，但培养在培养板中的细胞也可使用。）
- 使用添加5-10%新生小牛血清或胎牛血清以及1% L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素的Joklik改良MEM培养基，使贴壁细胞适应悬浮生长。在带有滤帽的旋转培养瓶中，于37 °C、8% CO2条件下培养细胞。
- 在细胞适应过程中，从500 ml旋转培养瓶中加入100 ml培养基开始。维持细胞密度不低于0.3 x 106 个细胞/ml，并每隔1-2天更换培养基，直至达到理想的生长速率（通常需要2-6周）。细胞成功适应后，悬浮培养的HeLa细胞大约每24小时增殖一倍。注意：在适应阶段，细胞需要一段时间才能恢复至正常的倍增速度。
- 将细胞维持在0.5-0.8 x 106 个细胞/ml的密度，并置于所需最终体积（通常为1-10 L）的培养体系中。
- 通常在对数生长期中期收获细胞（细胞密度约为0.5-0.65 x 106 个细胞/ml，且存活率>90%）。根据所需培养基体积选用合适规格的旋转培养瓶。
2. 核提取物
- 缓冲液与试剂配制
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
HIV-1 RNA 多聚腺苷酸化位点（poly(A) 位点）切割实验的代表性结果（图 2）。可以看到未切割的 RNA 底物，其为凝胶中迁移最慢、位于最上方的条带。特异性切割产物为强度最高的较短片段条带，其在凝胶中的迁移速度较快，大小符合预期，并且在含有 polyA 序列点突变（mutPolyA）RNA 底物的突变对照（mutpoly(A)）切割实验中特异性缺失。有时也可观察到输入底物的降解产物。切割活性的定量可通过密度分析图确定，即以未切割 RNA 为 100% 进行归一化处理后，计算未切割与切割 RNA 条带的比值。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在HeLa细胞核提取物中或使用从这些提取物中分离的切割因子进行的体外前体mRNA 3’端切割反应，已使得核心切割因子及其主要复合物得以鉴定16-21。近年来又发现了许多与这些因子相关的蛋白质22，而体外反应仍有望进一步揭示这些蛋白质在反应中的作用机制。可能由于该反应在体内似乎是共转录进行的23，或由于某些参与因子在提取和透析过程中可能丢失，该反应效率通常较低，很少能达到30%以上的切割率。此外，反应效率可能在不同天之间无明显原因地突然下降。因此，明确哪些步骤最为关键至关重要，尤其是在尝试将该反应体系应用于经修饰或病毒感染的HeLa细胞、其他细胞类型或新型底物时。
毫无疑问，提取物的质量和新鲜度 体外 转录的RNA至关重要，因此必须在严格无RNase的条件下操作。细胞在收获提取时的健康状态同样重要。细胞应呈现良好的生长状态，倍增时间应少于24小时，处于或接近对数生长期，且死亡细胞或其他无法解释的碎片应极少。显然，细胞不应受到支原体或其他细菌的污染。.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
S.V. 感谢美国国立卫生研究院（NIH K22AI077353）和兰登贝格基金会提供的经费支持。K.R. 感谢美国国立卫生研究院（5SC1GM083754）提供的经费支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 L Celstir 摇瓶 | Wheaton | 356884 | 提供不同规格 |
| 四位置低速搅拌器 | VWR | 12621-076 | |
| 摆动桶式离心机 | Beckman Coulter | Allegra x-15R 配 SX4500 转子 | |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra 配 SW41 转子 | |
| 台式离心机 5417R | Eppendorf | 带制冷功能 | |
| Thermomixer 恒温混匀仪 | Eppendorf | ||
| 250 ml 锥形离心管 | Corning | 430776 | |
| 50 ml 锥形离心管 | BD Falcon | 352098 | |
| Ultraclear 超速离心管 | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK 改良 MEM 培养基 | Lonza | 04-719Q | |
| 胎牛血清 | Atlas | F-0500-A | 经热灭活处理 |
| L-谷氨酰胺:青霉素:链霉素 | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| 氯化镁 | Fisher | BP214-500 | |
| 氯化钾 | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| 甘油 | Fisher | BP229-4 | |
| 5 M 氯化钠溶液 | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5 M 溶液 | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| 硫酸铵 | Fisher | A702-500 | |
| Complete 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer 透析盒套装 | Thermo Scientific | 66372 | 截留分子量 7,000，容量 0.5 ml–3 ml |
| 15 ml Dounce 组织研磨器套装 | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | 提供不同规格 |
| Expand 高保真 PCR 试剂盒 | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10 mM dNTP 混合液 | Invitrogen | Y02256 | 每种核苷酸浓度为 10 mM |
| MaxiScript SP6/T7 体外转录试剂盒 | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5')G RNA 帽结构 | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [α-32P] 250 μCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| 上样缓冲液 II | Ambion | 8546G | |
| DEPC 处理水 | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE 缓冲液 | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE 缓冲液 | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS 缓冲液 | Fisher | BP399-20 | |
| 尿素 | Fisher | BP169-212 | |
| 过硫酸铵 | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| 乙酸铵 | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺 | Bio-Rad | 161-0144 | |
| 糖原 | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% 绝对乙醇（200 proof） | Acros | 61509-0040 | |
| 酸性酚:氯仿 | Ambion | 9720 | 适用于 RNA 提取 |
| 闪烁液 | Fisher | SX18-4 | |
| RNase 抑制剂 | Promega | N261B | |
| 聚乙烯醇 - PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| 磷酸肌酸 | Calbiochem | 2380 | |
| 100 mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| 蛋白酶 K | Fisher | BP1700-100 | |
| 可调节测序装置 | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| 文件夹夹 | Office Depot | 838-056 | |
| 20 cm x 42 cm 玻璃板 | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1 套 |
| 20 cm x 22 cm 玻璃板 | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1 套 |
| 20 cm x 42 cm 铝制冷却板 | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1 件 |
| 0.4 mm x 22 cm 间隔条 | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1 套 |
| 0.4 mm x 42 cm 间隔条 | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1 套 |
| 8 孔梳 | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1 件 |
| 16 孔梳 | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1 件 |
| 32 孔梳 | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1 件 |
| 防粘胶涂层剂 | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | 或 SGR-0101（单瓶装） |
| 凝胶上样枪头 | Rainin | GT-10-4 | 0.1–10 μl |
| Sequencing PowerPac HV 电泳电源 | Bio-Rad | PowerPac HV | 5,000 V/500 mA/400 W |
| Gel Dryer Model 583 凝胶干燥仪 | Bio-Rad | Model 583 | |
| 凝胶干燥仪用 Hydrotech 真空泵 | Bio-Rad | ||
| Glogos II 夜光标记物 | Agilent | 420201 | |
| 8 x 10 尺寸胶片 | Midsci | BX810 | |
| 14 x 17 尺寸胶片 | Phenix | F-BX1417 | |
| 放射自显影暗盒 | Fisher | FBCA 1417 | 提供 8 x 10 尺寸 |
参考文献
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Wahle, E., Ruegsegger, U. 3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).
- Colgan, D. F., Manley, J. L.....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
