Ingénierie tissulaire de la tumeur stromale Microenvironnement avec application de Cancer Cell Invasion

Résumé

L'ingénierie tissulaire natif matrice dérivé des fibroblastes est un nouvel outil pour générer un substrat du stroma qui supporte la prolifération cellulaire et la différenciation epitheliale. Voici un protocole application de cette méthodologie pour évaluer l'impact de différents types de cellules stromales de la biologie des cellules tumorales est présenté.

Résumé

Cultures organotypiques 3D des cellules épithéliales sur une matrice incorporée avec les cellules mésenchymateuses sont largement utilisés pour étudier la différenciation des cellules epitheliales et l'invasion. Type de queue de rat collagène et / ou de la matrice dérivée de cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm ont été traditionnellement utilisé comme substrats pour modéliser la matrice ou stromale microenvironnement dans lequel les cellules mésenchymateuses (fibroblastes en général) sont remplies. Bien que des expériences à l'aide de ces matrices sont très instructifs, on peut affirmer qu'en raison d'une présence dominante d'une seule protéine (comme en collagène de type I) ou une teneur élevée en sous-sol composants de la membrane et des facteurs de croissance (tels que dans la matrice dérivée de la souris des cellules de sarcome), ces substrats ne reflètent pas la meilleure contribution de composition de matrice faite par les cellules stromales eux-mêmes. Pour étudier matrices indigènes produites par les fibroblastes dermiques primaires isolées de patients avec une tumeur sujettes, trouble génétique cloques (dystrophique récessiveépidermolyse bulleuse), nous avons adapté un protocole de matrice native existante pour étudier l'invasion des cellules tumorales. Les fibroblastes sont induites à produire leur propre matrice sur une période prolongée dans la culture. Cette matrice native est ensuite détaché de la boîte de culture et les cellules épithéliales sont ensemencés sur elle avant que l'ensemble de co-culture est portée à l'interface air-liquide. Différenciation et / ou l'invasion cellulaire peuvent ensuite être évaluées au cours du temps. Cette technique permet d'évaluer les interactions des cellules épithéliales-mésenchymateuses dans un environnement 3D sans la nécessité d'une matrice synthétique ou étrangère avec le seul inconvénient étant le laps de temps prolongé requis pour produire la matrice native. Nous décrivons ici l'application de cette technique pour évaluer la capacité d'une seule molécule exprimée par les fibroblastes, le collagène de type VII, d'inhiber l'invasion des cellules tumorales.

Introduction

L'utilisation d'un biomatériau dans une culture de tissu en 3D a permis aux chercheurs d'étudier le comportement des cellules dans le laboratoire dans des conditions physiologiques plus semblables à un environnement in vivo que celle de l'adhérence avec une récapitulé 2D et un substrat en matière plastique. En particulier, de grands progrès ont été réalisés dans la modélisation épithéliums stratifiés avec l'adoption de méthodes de culture 3D à l'interface air-liquide ^1-4. De telles techniques imitent fidèlement la différenciation des kératinocytes et l'invasion des cellules tumorales permettant une plus grande souplesse....

Protocole

Cette étude a été réalisée conformément à la Déclaration de principes d'Helsinki et a été approuvé par les comités d'éthique appropriés.

Une. Préparation des milieux et réactifs

1. Préparation de 200x de L-ascorbique 2-phosphate actions
   1. Dissoudre 29 mg de L-acide ascorbique-2-phosphate par 5 ml de milieu Eagle modifié de (DMEM) la solution de Dulbecco et filtrer sur filtre de 0,22 um de la membrane. Magasin de 0,25 ml aliquotes stériles -20 ° C.
   2. Ajouter 0,25 ml aliquote de 200x acide L-ascorbique-2-phosphate magasin pour chaque 50 ml de milieu de fibroblastes (DMEM avec 1% de L-glutamine et du sérum bovi....

Résultats

Cette technique ouvre la possibilité d'examiner et de comparer le comportement invasif des cellules tumorales (dans ce cas SCLC) sous différents environnements stromales 3D. En utilisant cette technique, non seulement des matrices indigènes C7-déficientes que récapitulées l'environnement EBDR cutanée peuvent être générés, mais aussi des matrices supplémentaires qui ont été génétiquement modifiées pour surexprimer C7 ^18. Comme le montre la figure 2, l'invasion des kératinocyt.......

Discussion

En raison de la nature de cette expérience, le temps total nécessaire pour l'achèvement peut être jusqu'à deux mois. Pendant tout ce temps, les pratiques de culture de soins et de tissus stérile maximum doivent être utilisés pour prévenir la contamination microbienne.

En plus de son rôle en tant que cofacteur dans la synthèse de l'hydroxyproline et de l'hydroxylysine des collagènes, de l'acide ascorbique stimule l'expression d'ARNm du c.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide L-ascorbique 2-phosphate	Sigma	A8960
DMEM avec L-glutamine, 4 500 mg/L D-glucose, 110 mg/L pyruvate de sodium	Life Technologies	11995-073
100x Pénicilline-Streptomycine	Life Technologies	15070
Vaseline	VWR	PROL28908.290
Cylindres clonaux	Sigma	Z370789
Disque filtrant en filet de nylon hydrophile 100 μ ; m 25 μ ; m diamètre 100/pqt	Millipore	NY1H02500
Support en treillis métallique en acier inoxydable plié	Fabriqué en interne		Les dimensions ont été faites de manière à ce que le treillis puisse s’insérer dans des plaques à 6 puits