Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l'applicazione di Invasion Cancer Cell

Sommario

Ingegneria tessutale fibroblasti derivati ​​da matrice nativa è uno strumento emergente per generare un substrato stromale che supporta la proliferazione delle cellule epiteliali e differenziazione. Ecco un protocollo di applicazione di tale metodologia per valutare l'impatto dei diversi tipi di cellule stromali sulla biologia delle cellule tumorali è presentato.

Abstract

Colture organotipiche 3D di cellule epiteliali su una matrice incorporata con cellule mesenchimali sono ampiamente utilizzati per studiare la differenziazione delle cellule epiteliali e invasione. Tipo di coda di ratto collagene e / o matrice derivata da cellule topo sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm è stato tradizionalmente impiegato come substrati per modellare il microambiente stromale o matrice in cui le cellule mesenchimali (di solito fibroblasti) sono popolate. Sebbene esperimenti utilizzando tali matrici sono molto informativo, si può affermare che a causa di una presenza prevalente di una singola proteina (come nel collagene tipo I) o un alto contenuto di componenti della membrana basale e fattori di crescita (come in matrice derivata da topo cellule di sarcoma), questi substrati non meglio riflettono il contributo alla composizione della matrice fatta dalle stesse cellule stromali. Per studiare matrici native prodotte da fibroblasti dermici primari isolati da pazienti con un tumore prona, vesciche disordine genetico (distrofica recessivaepidermolisi bollosa), abbiamo adattato un protocollo matrice originaria esistente per studiare l'invasione delle cellule tumorali. I fibroblasti sono indotte a produrre la propria matrice per un periodo prolungato in coltura. Questa matrice nativa viene poi staccato dal piatto di coltura e le cellule epiteliali vengono seminate su di esso prima che l'intera co-coltura viene generato all'interfaccia aria-liquido. Differenziazione e / o invasione cellulare possono essere valutati nel tempo. Questa tecnica consente di valutare le interazioni delle cellule epiteliali-mesenchimali in un ambiente 3D senza la necessità di una matrice sintetica o estere con l'unico svantaggio è il periodo prolungato di tempo richiesto per produrre la matrice nativa. Qui si descrive l'applicazione di questa tecnica per valutare la capacità di una singola molecola espressa dai fibroblasti, collagene tipo VII, di inibire l'invasione delle cellule tumorali.

Introduzione

L'uso di biomateriale in coltura tissutale 3D ha permesso ai ricercatori di studiare il comportamento delle cellule in laboratorio in condizioni fisiologiche più simile ad un ambiente in vivo di quella di una ricapitolato con adesione 2D e un substrato di plastica. In particolare, grandi passi avanti sono stati fatti nella modellazione epiteli stratificati con l'adozione di metodi di coltura 3D all'interfaccia aria-liquido ^1-4. Tali tecniche fedelmente imitare differenziazione dei cheratinociti e l'invasione delle cellule tumorali consentendo una maggiore flessibilità e fedeltà per i ricercatori che studiano questi processi. La sce....

Protocollo

Questo studio è stato condotto secondo la Dichiarazione di Helsinki Principi ed è stato approvato dai comitati etici competenti.

1. Preparazione dei Media e reagenti

1. Preparazione di 200x di acido L-ascorbico 2-fosfato magazzino
   1. Sciogliere 29 mg di acido L-ascorbico 2-fosfato per 5 ml di soluzione di Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM) e filtrare attraverso filtro a membrana 0,22 micron. Store come 0,25 ml aliquote sterili -20 ° C.
   2. Aggiungere 0,25 ml un'aliquota di 200x acido L-ascorbico magazzino 2-fosfato per ogni 50 ml di mezzi di fibroblasti (DMEM con 1% di L-glutammina e siero bovino fetale al 10%....

Risultati

Questa tecnica apre la possibilità di esaminare e confrontare il comportamento invasivo di cellule tumorali (in questo caso CSCC) in differenti ambienti stromali 3D. Utilizzando questa tecnica, non solo le matrici native C7-deficienti che ricapitolato l'ambiente RDEB cutanea possono essere generati, ma anche matrici aggiuntivi che sono stati geneticamente modificati per over-esprimono C7 ^18. Come si vede nella figura 2, invasione di cheratinociti RDEB CSCC era significativamente rit.......

Discussione

A causa della natura di questo esperimento, il tempo totale necessario per il completamento può essere fino a due mesi. In tutto questo tempo, di cura e del tessuto sterile necessità pratiche di coltura devono essere impiegati per prevenire la contaminazione microbica.

Oltre al suo ruolo come cofattore nella sintesi di idrossiprolina e idrossilisina di collagene, acido ascorbico stimola il collagene specifico mRNA in fibroblasti ^22. L'acido ascorbic.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido L-ascorbico 2-fosfato	Sigma	A8960
DMEM con L-glutammina, 4.500 mg/L D-glucosio, 110 mg/L di piruvato di sodio	Life Technologies	11995-073
100x Penicillina-Streptomicina	Life Technologies	15070
Vaselina	VWR	PROL28908.290
Cilindri clonali	Sigma	Z370789
Disco filtrante in rete di nylon idrofilo 100 μ m 25 μ m diametro 100/pk	Millipore	NY1H02500
Supporto in rete metallica piegata in acciaio inox	Prodotto in casa		Le dimensioni sono state realizzate in modo che la rete si inserisse in piastre a 6 pozzetti