Method Article

פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

DOI:

10.3791/51362

⸱

June 26th, 2014

 ,  , 
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נגיף הפטיטיס C (HCV) הוא פתוגן אנושי עיקרי הגורם להפרעות בכבד, כולל שחמת וסרטן. מערכת תרבית תאים זיהומית HCV חיונית להבנת המנגנון המולקולרי של שכפול HCV ולפיתוח גישות טיפוליות חדשות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לחקירת שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוס הפטיטיס C (HCV) משפיע על 3% מאוכלוסיית העולם של וגורם למחלות חמורות בכבד כולל צהבת כרונית, שחמת הכבד, וקרצינומה hepatocellular. HCV הוא נגיף RNA אפף השייכת למשפחה Flaviviridae. טיפול הנוכחי אינו יעיל באופן מלא וגורם לתופעות לוואי שליליות. אין חיסון HCV זמין. לפיכך, מאמץ המשיך נדרש לפיתוח חיסון וטיפול טוב יותר. מערכת תרבית תאי HCV היא קריטית ללימוד שלבים שונים של צמיחת HCV כוללים כניסת ויראלי, שכפול הגנום, אריזה, ויציאה. בהליך הנוכחי שהוצג, השתמשנו וירוס 2a intragenotype פראי מסוג chimeric, FNX-HCV, ווירוס רקומביננטי FNX-Rluc נושא גן כתב לוציפראז Renilla ללמוד את שכפול הנגיף. שורת תאי hepatoma אדם (מבוסס הא-7) שימשה עבור transfection של במבחנה עיבד RNAs גנומית HCV. supernatants תא ללא תרבות, lysates חלבון ולאRNA סך נקצרו בזמן שונים מציין שלאחר transfection להעריך צמיחת HCV. מעמד שכפול הגנום HCV הוערך על ידי RT-PCR ופעמים תקועים RNA לדמיין את הנוכחות של HCV. ביטוי חלבון HCV אומת על ידי מבחני כתם וimmunofluorescence מערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבוני HCV NS3 וNS5A. תאי transfected RNA HCV שוחררו חלקיקים זיהומיות לsupernatant התרבות וכייל הנגיף נמדדו. מבחני לוציפראז נוצלו כדי להעריך את רמת השכפול והדבקה של HCV כתב. לסיכום, אנו מציגים מבחני virological שונים לאפיון שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוס הפטיטיס C (HCV) גורם לשחמת כבד וסרטן כבד. זה משפיע 170 מיליון אנשים ברחבי העולם עם 350,000 אנשים מתים מדי שנה 1-3. HCV הוא נגיף RNA גדיל חיובי עם גודל הגנום של 9.6 kb. הגנום HCV מתורגם כמו polyprotein יחיד של ~ 3,000 שאריות חומצת אמינו שהוא ביקע proteolytically ידי פרוטאזות נגיפיות סלולריות שונות ל10 פוליפפטידים. HCV הוא נגיף אב הטיפוס בסוג Hepacivirus ושייך למשפחה של 4 Flaviviridae. עם החשיפה, HCV קובע זיהום כרוני ב80% מהאנשים. הזיהום הוא בעיקר ללא תסמינים בזמן אבחון יכול לאפשר התערבות טיפולית כדי למנוע הידרדרות בכבד. טיפול הנוכחי הוא הכי מוצלח ואין חיסון זמין 5,6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתווה כללית של הפרוטוקול מתואר באיור 1.

1. תאים

  1. הכן תקשורת צמיחה מלאה שמכילה 10-15% בסרום שור העובר (FBS), 10 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, 10 HEPES מ"מ, פניצילין (100 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (100 מ"ג / מיליליטר), ו2 מ"מ L-גלוטמין.
  2. לשמור על הא-7.5.1 תאים 13 בתקשורת צמיחה מלאה המכילה תוספים מעל לניתוח במבחנה של מחזור שכפול נגיפי צהבת מסוג C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נגיף הפטיטיס C הוא וירוס RNA. כך למטרה מניפולציה גנטית, cDNA גנומי HCV כבר משובט לתוך וקטור פלסמיד חיידקים. רצף אמרגן RNA פולימראז T7 הוצג מייד לפני סוף '5 של הגנום HCV. מתווה כללית של עבודה ניתוח HCV מוצגת באיור 1. כדי לייצר RNA הגנומי HCV עם הסוף מדויק 3 ', הגנום HCV המכיל פלסמיד הוא חתך עם אנזים הגבלת Xba אני והסככה חד גדילים שנוצרה הייתה קהה עם עיכול nuclease שעועית מונג . איכות פלסמיד HCV ינארית הוערכה על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose (איור 2)........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור זה מתאר שיטה לניתוח מחזור השכפול של וירוס הצהבת מסוג C. HCV הוא הפתוגן אנושי ופרוטוקול הבטיחות הביולוגי שנקבע יהיה חייב להיות אחריו בקפדנות. מערכות תרבות זיהומיות HCV תא תוארו בעבר 11-13,16,17. יש כמה נקודות קריטיות שאנחנו ליישם כאשר בעקבות הפרוטוקול המאויר. ראשית, זה הוא בעל חשיבות גבוהה שיש באיכות טובה של רנ"א הנגיפי שלם באורך מלא גנומי ללימודים במורד הזרם. פלסמיד שנשא הקלט cDNA הנגיפי צריך להיות לינארית והקהה בזהירות. Nuclease מונג השעועית מועסק כדי להקהות .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ל-F. Chisari על אספקת קו התאים Huh-7.5.1. ברצוננו להודות לג'סטין הו על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס המחקר הפרוגרמטי המוסדי של המרכז הרפואי Cedars-Sinai והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, מענק UL1TR000124 ל-V.A.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דולבקו s שונה Eagle' s medium (DMEM)פישר סיינטיפיק10-017-CV
חומצת אמינו לא חיוניתפישר סיינטיפיקMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM סרום מופחת בינוני, ללא פנול RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1המחקר סקריפסקו התאים סופק באדיבות על ידי ד"ר פרנסיס צ'יסארי לד"ר ארומוגסוואמי תחת MTA שבוצע בין מכון המחקר סקריפס לבין הפלסמידים של המרכז הרפואי Cedars-Sinai
(pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc ו-pFNX-Rluc Pol null) הרפואי Cedars-Sinaiהפלסמידים של HCV סונתזו על ידי ד"ר ארומוגסוואמי באמצעות אוליגו-נוקלאוטידים חופפים.
XbaIניו אינגלנד ביולאבס בע"מR0145S
מונג שעועית נוקלאזניו אינגלנד ביולאבס בע"מM0250S
T7 RiboMAX אקספרס מערכת ייצור RNA בקנה מידה גדולPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 מ"מ)BioexpressE-5010-4
Gene Pulser Xcell Total SystemBio-Rad165-2660
נוגדן חד שבטי נגד dsRNA J2 אנגלית & ייעוץ מדעי Kft.
עיזים נגד ארנב IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
עיזים נגד ארנב IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
PVDF חבילת ממברנהBio-Rad162-0263
חוסם כיתה ספיגה חלב יבש ללא שומןBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
נוגדן נגד נגיף הפטיטיס C NS3 [8 G-2]Abcamab65407
נוגדן נגד נגיף הפטיטיס C NS3 [H23]Abcamab13830
עז נגד עכבר IgG מצומד עם חזרת פרוקסידאז (HRP) מעבדות ג'קסון אימונו-מחקר בע"מ115-035-003
אמרשם ECL פריים ווסטרן ריאגנטים לזיהוי כתמים GE Healthcare Life SciencesRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
ViiA 7 מערכת PCR בזמן אמתLife Technologiesערכת
Renilla LuciferasePromegaE2810
DNase PromegaM6101
GloMax-Multi Detection System (לומינומטר)פרומגה
מכון המרכז 10010200 מערכת בדיקה NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis C VirusHCV ReplicationViral RNA TransfectionQuantitative RT PCRWestern BlotImmunofluorescence AssayViral Titer MeasurementLuciferase AssayCell Culture SupernatantHuh 7 Cells

Related Articles