ここでは、GABA海馬ニューロンにおける受容体表面局在およびエンドサイトーシスを測定するために、ブンガロトキシンをαに結合された蛍光Alexaの色素の使用を示す。 α-ブンガロトキシンに結合する細胞外の短いタグを有する構築物の使用によって、血漿膜タンパク質のエンドサイトーシス輸送の分析を達成することができる。
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この記事について
サマリー
要約
これは、ますます明らかであるイオンチャネル型GABA A受容体（GABAAR）、展示高度に動的な輸送および細胞表面移動度1-7を含む神経伝達物質受容体、。受容体細胞表面局在化およびエンドサイトーシスを研究するために、ここに記載された技術は、α-ブンガロトキシン（BGT）結合部位（BBS）を含む構築物を発現する細胞と蛍光α-ブンガロトキシンの使用を兼ね備えています。 BBS（WRYYESSLEPYPD）は、高親和性8,9でBGTをバインドし、筋肉ニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニットに基づいています。掲示板サイトの取り込みは、以前に、GABA Aと代謝型GABABの追跡2,10受容体で説明したように、表面局在および受容体の挿入または外因性蛍光BGTの適用と除去の測定を可能にする。 BBS部位に加えて、我々は標準mで成熟GABAARサブユニットのアミノ酸4と5の間のpH感受性GFP（pHGFP 11）に挿入olecular分子生物学およびPCRクローニングストラテジー12（ 図1参照）。 BBSは、13個のアミノ酸のアラニン/プロリンリンカーにより分離、pH感受性GFPレポーターの3 'である。固定したサンプルに基づいており、この文書に記載されて人身売買の研究のために、pHGFPが全体の記者がBGTの正規化は、全受容体集団に受容体集団をラベル付けできるように、GABAARサブユニットタンパク質レベルタグとして機能します。これはタグ付けされたGABAARサブユニットの高いまたは低いベースライン発現に起因する細胞BGT染色シグナルの変動にセルを最小限に抑えることができます。さらにpHGFPタグは、ライブまたは固定イメージング実験用の細胞を発現する構築物を容易に識別することができます。
概要
の蛍光体の局在とダイナミクスを研究するため、α-ブンガロトキシンを結合された使用は、ニコチン性アセチルコリン受容体13〜15、毒素の内因性標的の研究で開拓された。続いて、最小限のBGT結合ペプチド（BBS）の組み込みは、興奮性および阻害性リガンド依存性イオンチャネルおよびGタンパク質共役受容体2,10,16-21両方の輸送を研究するために使用されている。このBBSベースの技術は、表面ビオチン化法、細胞外エピトープに対する抗体を用いた生細胞の抗体標識、および（FRAP）を光退色後蛍光回復などの人身売買の研究に使用される他のアプローチには利点を提供します。細胞表面の間にビオチン化遊離アミンが共有結合し細胞活性に影響を与える可能性を秘めた、変更されます。抗体ベースの研究は、多くの場合、人身売買のイベントを変更することができ、表面抗原クラスタリングまたはキャッピングによって妨げられてきた。原因FRAP sの漂白工程へtudies、重要な関心事は、下にある細胞構造を損傷している。さらなる利点は、BBSが構築物はまた、ビオチン結合ロバにブンガロトキシン受容体の輸送生化学手法を用いることができるタグ付けすることである。この技術は、細胞株および初代細胞に容易に適用可能である。示されるように、ニコチン性アセチルコリン（nAChRの）受容体を発現する細胞で使用するためには、のnAChR拮抗ツボクラリンは、プロトコル全体で使用されている必要があります。ツボクラリンの非存在下でトランスフェクトしていない細胞に（....
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プロトコル
以下に説明されているすべてのプロトコルは、動物実験委員会と医学のピッツバーグ大学大学院のIRB制度審査委員会に従う。
1。組織培養フード内の海馬ニューロン培養の調製
注意：プロトコル1全体で使用無菌技術および試薬を。
- 神経細胞培養のための基質としてポリ-D-リジン（0.1 mg / mlの中のH 2 O）、コーティングされたガラス製カバースリップを準備します。
- 各3.5センチメートル組織培養皿の内側4-5ラウンドガラス製カバースリップを配置。
- 各12ミリメートルのカバーガラス上にスポット70μlのポリ-D-リジン。注：ライブイメージングのために、ガラスは、（埋め込まれた14ミリメートルのガラス製カバースリップ上に200μlのポリ-D-リジンを発見）3.5 cmの組織培養皿を用いることができる有底。
- 組織培養フードのO / Nで惣菜を残すポリ-D-リジンの蒸発を最小限に抑え、組織培養フードに無菌表面を保ち、窓サッシを閉鎖し、目をオフにするにはEブロワーのO / N注意：UVランプは、O / Nインキュベーション中に使用されていません。
- 翌朝、食器は、H 2 Oの2ミリリットルで3回洗浄
- 最後のH 2 Oの洗浄を除去した後、各3.5センチメートル皿にメディアの2ミリリットルを追加し、ステップ1.4....
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結果
BBSタグ付けされた構造のキャラクタリゼーションは、発現されたタンパク質は（特に複数のサブユニットからなる受容体に）適切に組み立てるかどうかを判断するなどの重要なコントロールが含まれ、細胞表面にトラフィックを適切局在する。抑制性シナプスは、阻害足場タンパク質ゲフィリンと共局在し、シナプス小胞（VIAAT / VGAT）にGABAおよびグリシンをロード水疱性抑制性アミノ酸トランスポーターによって識別されるシナプス前抑制端末に並置された受容体表面のクラスターは、GABAで構成されています。 図2に示されている抗GFP抗体を用いた総受容体集団の免疫染色し、シナプス後抑制性足場タンパク質のゲフィリン（ 図2A）またはVIAAT（ 図2B）のいずれかに続いてBGTで標識された表面GABAARで発現ニューロンα2pHGFP+掲示板です。
図3は、αのエンドサイトーシスを示しています2 15 DIVの海馬神経細胞にGABAARを含む。パネル（
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ディスカッション
ここで説明するBBS基づいて、固定技術は、生細胞株、ニューロン、および他の一次細胞における受容体または他の原形質膜タンパク質の輸送を追跡するために使用することができる。この方法は、正常膜挿入およびリガンド依存性イオンチャネルの除去およびGPCRを研究による受容体アゴニストおよびモジュレーターの存在下にトラフィッキングの変化を評価するために使用されている。重要な側面は、適切な細胞外の場所にタグの局在とBBSの添加を確実にするための制御を行う（GFPなど他の記者のための標準として）機能的に沈黙しているが含まれています。示されるように、ニコチン性アセチルコリン（nAChRの）受容体を発現する細胞で使用するためには、のnAChR拮抗ツボクラリンは、プロトコル全体で使用されている必要があります。追加のGFPタグが使用されない場合、合計BBSは、タンパク質レベルは、追加の固定後に別のフルオロフォアに結合されたα-ブンガロトキシンとpermeabilizによる染色を介して決定することができるタグ付きATION。目的の受容体/タンパク質のエンドサイトーシスの速度を測定するための時点の選択は、以上の時点の初期使用と組み合わせ、受容体/タンパク質のための人.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
サポートは、医学のピッツバーグ大学大学院の薬理学およびケミカルバイオロジー部門からスタートアップ資金によって提供された。ニコラス·グラフ：ビデオの提出に貢献ヤコブラボメンバーの謝辞。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| P3 Primary Cell 4Dキット | ロンザ | V4XP-3024 | |
| &-ブンガロトキシン、アレクサフルーア 647 コンジュゲート | 分子プローブ | B35450 | |
| &-ブンガロトキシン、アレクサフルオア 488 コンジュゲート | 分子プローブ | B13422 | |
| &-ブンガロトキシン、アレクサフルーア 594 コンジュゲート | 分子プローブ | B13423 | |
| (+)-塩化ツボクラリン | トクリス | 2820 | |
| 実装媒体 | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin 抗体 | シナプス | システム 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT 抗体 | シナプス | システム 131 002 | 1:1,000 |
| 抗 GFP | ライフ テクノロジー | ズ A6455 | 1:2,000 |
| ガラス底組織培養皿 | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek 皿 | |
| カバースリップ (丸型カバーガラス)、#1 厚さ、12 mm | ワーナー・インスツルメンツ | 640-0702 |
参考文献
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. E....
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再版と許可
