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方法論記事

小脳軸索のレーザーNanosurgery

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DOI:

10.3791/51371

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2014年7月28日

 ,  , 
1European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, University of Florence, 2National Institute of Optics, National Research Council, 3Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 4International Center for Computational Neurophotonics (ICON Foundation)

この記事について

サマリー

レーザーnanodissectionに結合された2つの光子イメージングは​​、細胞内の分解能で中枢神経系の変性と再生のプロセスを研究するための有用なツールである。このプロトコルは、ラベル画像、およびin vivoでの小脳皮質内の単一の登山繊維を分析する方法を示しています。

要約

成体哺乳類の中枢神経系(CNS)では、軸索の解剖時に局所的な再成長を示す神経細胞集団がごくわずかです。神経細胞の再生を促進するメカニズムを理解するためには、損傷後にリモデリングが可能な神経細胞の種類を深く分析する必要があります。いくつかの研究は、損傷したクライミング繊維が成体動物でも再成長できることを示しました1,2。これらの軸索の複雑な環境下での変性と再生のタイムラプスダイナミクスの調査は、in vivo3,4のタイムラプス二光子蛍光(TPF)イメージングによって実行できます。この技術は、ここではレーザー手術と組み合わされており、レーザー手術は、無傷のマウス皮質5-9の蛍光構造を破壊するための非常に選択的なツールであることが証明されています。

このプロトコルは、in vivoで小脳の単一軸索枝のTPFタイムラプスイメージングとレーザーナノ手術を行う方法を説明しています。乏脳ニューロンは、デキストラン結合色素による順行性トレーシングによって標識され、頭蓋窓を介したTPFイメージングによって監視されます。次に、軸索の末端部分を高出力のTi:Sapphireレーザーを照射することにより解剖します。損傷したニューロンの変性と潜在的な再成長は、損傷後の数日間、TPF in vivoイメージングによって監視されます。

概要

機械的損傷、毒性傷害または神経変性疾患から生じる軸索切断は、通常、細胞体10-13から取り外された軸索の遠位部分の変性が続く。いくつかの例外を除い2,7,14,15で、成体動物のCNS ​​における切断軸索は通常、再成長プログラム16をアクティブにすることはできません。

リトルは、細胞および細胞内レベルでの変性のイベントをリアルタイムでダイナミクスについてはほとんど知られていない。神経損傷を制限し、神経細胞の再生を促進するための新たな戦略の開発を単独で負傷した神経細胞が退化して再生成するメカニズムを明らかにし、最初のステップとして、必要とします。この研究は、最も直接的に生体内での単一ニューロンのダイナミクスを監視することで対処されている。一光子蛍光イメージング技術は、可視光の強い散乱によって制限されるが、二光子励起は、リチウムの深い皮質層に到達する細胞内分解能3,4,17でマウスを見る。蛍光タンパク質を選択的に18-20ニューロンの亜集団で発現させたトランスジェニックマウスを利用して、TPF顕微鏡21,22は、 インビボでの開発の際のシナプスの可塑性および軸索伸長の探査に適用されている。単独で損傷を受けたニューロンのT彼の能力に損傷が特に関心のある軸索を対象と傷害のモデルと2光子イメージングによる生体モニタリングにカップリングすることによって調べることができる後の再成長。フェムト秒パルスの多光子吸収は、単一の樹状突起または単一の棘5,23を破壊するために使用されている。また、この損傷パラダイムは連絡デンドライト6を中断させることなく、単一の軸索の枝を切ることができます。一度損傷し、小脳登山繊維（CFS）、その軸索を再生するために、特定のニューロン集団を許可する機能を解剖するのコンテキスト内で有用なモデルSiがあるNCE彼らも成体動物24,25における損傷後の顕著な塑性特性を保持する。最近でのCFの長期イメージングは、これらの軸索は、レーザー軸索切断6に従う日で再成長させることが可能であることを示した。

このプロトコルは、順行性トレースを通じてオリーブ小脳の神経細胞とその軸索伸長にラベルを付ける方法を説明します。近隣のニューロンが蛍光標識されると、それらは頭蓋窓の下で数週間または数ヶ月間の任意の時点で繰り返し監視することができる。 生体内でのレーザー軸索切断により、単一の軸索の分岐を分析する手順は、次に説明する。

ここで紹介するテクニックは、in vivoでの軸索リモデリングのメカニズムに新たな洞察を提供し、神経変性を制限し、軸索再生を促進するための治療戦略の開発を助けるかもしれない。

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プロトコル

1。軸索のラベリング

  1. クライミング繊維は、高分子量デキストランまたは蛍光タンパク質26-29の発現を誘導するプラスミド/ウイルスにコンジュゲート有機染料のいずれかを注入することによって標識することができる。このプロトコルでは、有機色素アレクサフルーアデキストラン488が登山繊維を標識し、小脳皮質（ 図1）でそれらを視覚化する下オリーブに注入される。ここで説明するすべての手順は、厚生労働省のイタリアで承認されている。
  2. マイクロピペットプラー上に引いてガラス毛細管を準備します。外径が約30μmになるまでハサミでガラスキャピラリーチューブの先端をトリミング。
  3. デキストラン共役系色素の1〜2μlのキャピラリーをロードします。
  4. 開始する前に、オートクレーブ内のすべての手術器具を滅菌する。処置中に、ガラスビーズ滅菌器を用いて、汚染のリスクを低減する。
  5. 9月12日（マウスを麻酔ケタミン（90 mg / kgで）およびキシラジン（10 mg / kg）を腹腔内注射によって週）。動物が完全に尾および/またはつま先のピンチを使用して鎮静されていることを確認。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
  6. かみそりの刃や脱毛クリームのいずれかと首上の毛を剃る。エタノール70％と交互にベタジンで2回手術部位に綿棒。
  7. 定位ホルダーにマウスを置きます。加熱パッドで動物を暖かく保つ。
  8. ヘッドがしっかりと保持されるように、ゆっくりと耳の横の骨にearbarsを押してください。ボディと140°の角度をなすように頭を回転させます。所望の配向を穏やかに定位ホルダーにノーズホルダロッドの高さを変化させることによって得ることができる。
  9. 耳の間の皮膚にリドカインの数滴を適用します。後頭部下の皮膚に約1cmの縦切開を行うために鉗子やカミソリの刃を使用してください。
  10. 優しく鈍ピンセットで皮下組織や筋肉を分離解剖顕微鏡下でのS。水平筋肉の束を下に押して、大後頭孔を介して硬膜を露出させるために、二つの垂直の筋肉の線維束を離れて保持する。
  11. 細心の注意を使用して、脳幹を露出するために注射針または非常に鋭いピンセットで硬膜を解剖。硬膜が切断されたときに脳脊髄液の少量のこぼれてもよい。
  12. 定位マイクロマニピュレータに、垂直からキャピラリー45°のホルダーを回転させます。小脳皮質及び第一頸椎の尾側縁部との間の中間点に、正中線でキャピラリーを配置します。表面から2mmの深さで、ピペットを挿入します。
  13. 10〜15分かけて、染料の0.5〜1.5μlの容量を提供します。マイクロインジェクション分配システムは、毛細管内の液体の制御された圧力の配信を可能にする（脈圧= 20 PSI、パルス持続時間= 3〜4ミリ秒、パルス供給= 12ヘルツの周波数）。
  14. その後、15分間の場所に毛細血管を残すslowl（2〜3分）、Yはそれを削除します。微妙に筋肉を再調整し、上記の皮膚を縫合。よく全体の手順を通して、いくつかの生理食塩水を適用することにより、水和した筋肉を維持。
  15. 脱水を避けるために、皮下に0.5ミリリットルの0.9％のNaClを注入する。麻酔から完全に回復するまで加熱ケージに動物を保管してください。
  16. 皮下手術後2〜3日間、毎日カルプロフェン（5 mg / kgの）を管理。

小脳皮質に2。光学窓

注：色素（ 図1を参照）のCFS端末への小脳皮質に下オリーブ核から上2週間以内に輸送される。まばらにラベルされたCFSは、以下のように行うことができる永久頭蓋窓の下で可視化することができる。

  1. すべての手術器具を滅菌する。
  2. 前述したように、マウスを麻酔。動物をチェックするためにつま先のピンチを使用し、完全に鎮静されている。
  3. SKを拭く、頭の上に髪を剃る70％アルコールおよびベタジンの交互スワイプで中や眼軟膏を適用します。定位フレームにマウスを置き、しっかりと頭を保持するために耳のバーを配置します。
  4. 皮下頭蓋窓サイトで脳と可能な炎症の腫れを防ぐために、デキサメタゾン（0.2 mg / kg）をし、カルプロフェン（5 mg / kgの）を管理。
  5. 耳の間から目の上に、頭蓋骨の上の皮膚にリドカインの低下を適用し、フラップをカット。メスでそれをこする前に骨膜上に再びリドカイン溶液を適用します。
  6. 小脳上記の頭蓋骨の薄い半円形の領域に歯科用ドリルを使用してください。頭蓋骨の深さは半円の周囲全体にわたってほぼ一定であるように、ウィンドウは、通常、中枢及び裏面に向かって縫合糸配置されている。この非常に厚い領域上のラムダ縫合および反復的な掘削に近すぎるウィンドウを配置すると、浮腫の脳と形成の過熱の原因となります。
  7. 止血の適用出血例で頭蓋骨にスポンジ。
  8. カミソリの刃やピンセットの助けを借りて、2等分にカバーガラスをカットします。カバーガラスは、骨の島よりも大きめにピンセットで骨のフラップを削除する前に、同じような形状をしていることを確認してください。いない場合は、カバーガラスの形状を変更、または別のものを選択してください。骨をオフに描きながらピンセットで硬膜に手を触れないでください。慎重に硬膜上にカバーガラスを置く。注：硬膜上にガラスの全面の付着が長期的な頭蓋のウィンドウの予言されている。
  9. 繰り返しコットンスティックで生理食塩水を用いてリンスして乾燥さガラスの下に気泡を除去。また、これはガラスを配置した後、小さな毛細血管からこぼれするかもしれないいくつかの残留血液を取り除くのに役立ちます。アクリル接着剤と歯科用セメント30の混合物で窓をシール。
  10. 完全に麻酔から回復するまで、回復室での加熱パッド上に動物を保管してください。再しないでください完全に回復するまで、ホームケージにマウスを回す。彼らは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人のままにしないでください。
  11. 皮下手術後2〜3日間、毎日カルプロフェン（5 mg / kgの）を管理。

3。 インビボ多光子レーザー軸索切断

  1. 第1の撮像セッションを実行する前に、手術から2〜7日待ちます。第ガルバノミラーの対によってスキャンした後、水浸20Xによって試料上に集束されるサファイアレーザ光源（120 fsの幅のパルス、90MHzの繰り返し率）：ここで使用される特注の二光子顕微鏡のTiが設けられている目的（NA 0.95、WD 2ミリメートル）。クローズドループピエゾステージは、客観的に400程度までの軸方向変位を実行します。光電子増倍管は、蛍光シグナルを収集します。
  2. 頭蓋窓がobjectiと平行にかぶさるように、動物を麻酔し、定位ホルダーにヘッドの位置決め焦点面を見る。
  3. TPFは頭蓋窓の下皮質を画像化して探る。最も明るいものの中で破損する軸索を選択してください。
  4. Z-スタックを取得する標的軸索の3次元再構成を得るために、（通常は視野は512×512ピクセル、2μmのZ軸ステップで、100×100μm2である。）画像化されたボリュームの中では、焦点面に主に並列にある軸索の枝に病変部位を選択します。この配向は、急速に成功した解剖を予測する形態学的変化を、得点することができます。
  5. CFの末端部分の選択された点用量、高エネルギーを照射。これは、LabVIEWソフトウェアを介して行われます。（〜4ラインスキャンを行うためのガルバノミラーの位置を設定し、画像化（対物レンズの後に測定≈300 MW、）に使用される電力よりも5〜10倍以上のレーザーパワーを上げる - 10μm）を、損傷部位での400のためのレーザシャッタ開 - 600ミリ秒。ラインスキャンを配向CF面に垂直な軸索を完全に離断する。明るいスポット（ 例えば 、静脈瘤）を照射すると、通常軸索を解剖するのに役立ちます。レーザー軸索切断用の波長は、イメージング（920 nm）を使用したのと同じである。
  6. 通常照射領域における軸索の蛍光は、一過性に起因する光退色に減少する。アブレーションがうまく実行されたことを確認するために数分照射後の同じ領域のスタックを取得する。領域は膨潤を開始し、軸索がビーズ様構造を形成する場合、ニューロンは、正常に解剖された。この場合は、数時間（分、数十から24時間まで）で軸索の先端部分は退化し、完全に消えてしまいます。
  7. 残念ながら、完全な軸索切断を生成するために必要なエネルギー量は常に予測できません。照射の結果のみが光退色している​​場合、蛍光が急速に拡散を染色するために回収されるべきであり、照射が有効に再び繰り返されるべきであるLY軸索を解剖。また、ケース内の腫れの兆候は5内に表示されない-の増加、新規スキャンで再試行して、（。同様にレーザーdendrotomyについて説明したものに、アレグラMascaro ら 23を参照）、20分、または腫脹は回復が続いている時間および/またはレーザパワーを滞留。
  8. インビボイメージング2光子レーザの軸索切断に追従日での最終的な軸索 ​​リモデリングをモニタリング（ 図2および図3）。血管パターンは、次の日で解剖軸索を取得するために基準パターンとして使用される。
  9. 皮下カルプロフェン（5 mg / kg）を、実験の全期間ごとに撮像セッションを管理します。

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結果

このプロトコルは、単一のニューロンに軸索のラベリング、in vivoイメージングやレーザー軸索切断を実行する方法を説明した。実験のタイムラインを図1に示す。

アレクサフルーア488デキストランで標識し、in vivoでの二光子顕微鏡法による頭蓋窓の下で可視化したCFの一例を図2に報告されている。6,27、以前に報告したように、昇順枝は数日間の観察期間にわたって高い安定性を示す。

図3は、CFの単一の分岐のレーザー軸索切断による軸索切断の例を示しています。前述したように、損傷が赤外光の高エネルギー線量とCFの遠位分岐（〜軟膜下に30μm）を照射することにより行った。 図3の第2のパネルに示すように、15分間、レーザー照射後の軸索の遠位部分は膨潤を開始し、degene評価。翌日、軸索先端の部分病変部位が完全に消失しま...

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ディスカッション

このプロトコルは、蛍光色素で下オリーブのニューロンを標識する方法を示しています。続いて、小脳皮質上の頭蓋窓を実行するための方法が記載されている。この手法は、オリーブ小脳ニューロン、登山繊維の末端部分に光アクセスを提供します。残念ながら、両方のラベリングと開頭手術の結果も、熟練したオペレータの手の中に極めて低い（3匹のマウスのうち、通常は1標識し、3頭側の窓のうち1〜2週間後に透明のままです）。

生きたマウスでは、レーザー軸索切断を実行するための手順は、次に示されている。この方法は、対象のサイト内の蛍光ニューロンを解剖ができます。一般的に使用される損傷のパラダイムは、機械的切断または化学物質を用いて、脳組織の大規模な破壊を引き起こすが、このモデルの主な強みは、高い空間閉じ込めおよび特異性である。確かに、これまでの研究では、Tを温存しながら、単一の棘がアブレーションできることを示した彼の親樹状突起5の構造的完全性;また、単一の軸索の枝は、永続6グリア性瘢痕の形成を回避破壊することができる。変性プロセスは、負傷したニューロンのリアルタイム、なら...

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開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

注射に関する技術支援を提供してくださったErica Lorenzettiさんと、図1を作成してくださったIrene Costantiniさんに感謝いたします。これらの結果につながる研究は、LASERLABEUROPE(Grant 284464、欧州委員会の第7次フレームワークプログラム)から資金提供を受けています。この研究プロジェクトは、フラッグシッププロジェクトNANOMAXの枠組みでイタリアの教育大学研究省によって、および「Stem Cells Call for Proposals」の枠組みでイタリアの保健省によっても支援されています。この作業は、European Flagship Human Brain Projectの研究活動の一部であり、International Center of Computational Neurophotonics財団の支援を受けて実施されています。「Ente Cassa di Risparmio di Firenze」。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ラボ標準定位固定装置、ラットおよびマウスStoelting 51670
フィラメント付きホウケイ酸ガラスSutter Instrument IncBF100-50-10
Germinator 500 (Glass bead sterilizer)Roboz
Microinjection dispense systemPicospritzer
小径丸型カバーガラス、#1 厚さ、3 mm、100 パック (CS-3R)Warner Instruments 64-0720
Ti:サファイアレーザ、120 fsec幅パルス、90 MHz繰り返し周波数CoherentChameleon 
スポンジ、止血スポンジロサンMS0005
ガルバノメトリックミラー GSI LumonicsVM500+
対物レンズオリンパスXLUMPLFLN 20XW
圧電ステージ Physik InstrumenteP-721
光電子増倍管モジュール 浜松ホトニクスH7710-13
LabVIEW システム設計ソフトウェアNational Instruments
Voren, 1 mg/ml (デキサメタゾン-21- イソニコチン酸)Boheringer Ingelheim
Rymadil (carprofen) ファイザー
リドカインクロロハイドレート2%ATI
Alexa488デキストランライフテクノロジーズD22910
フェ

参考文献

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