يصف بروتوكول الفحص micropocket القرنية كما وضعت في الفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
والقرنية Micropocket الفحص: نموذج من الأوعية الدموية في العين ماوس
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الماوس القرنية micropocket الفحص هو فحص قوي والكمي في الجسم الحي لتقييم الأوعية الدموية. باستخدام الكريات بطء الإفراج موحدة تحتوي على عوامل النمو المحددة التي تؤدي إلى نمو الأوعية الدموية في جميع أنحاء القرنية اوعائي بشكل طبيعي، الأوعية الدموية يمكن قياسها كميا و. في هذا الاختبار يتم إنشاء استجابة عائية على مدار عدة أيام، وهذا يتوقف على نوع وجرعة من عامل النمو المستخدمة. يتم تشغيل تحريض اتساع الأوعية الدموية عادة إما عاملا أساسيا نمو الخلايا الليفية (bFGF) أو عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF). من خلال الجمع بين هذه العوامل النمو مع sucralfate وhydron (بولي HEMA (بولي (ميتاكريليت 2 هيدروكسي))) وصب الخليط في الكريات، ويمكن زرعها جراحيا في العين الماوس. هذه الكريات موحدة ببطء الافراج عن عوامل النمو أكثر من خمسة أو ستة أيام (bFGF أو VEGF على التوالي) مما يتيح استجابة عائية الكافية اللازمة لف منطقة السفينةuantification باستخدام المصباح الشقي. هذا الاختبار يمكن استخدامها لمختلف التطبيقات، بما في ذلك تقييم المخدرات المغير عائية أو العلاجات وكذلك المقارنة بين خلفيات وراثية مختلفة تؤثر على الأوعية الدموية. محقق المهرة بعد ممارسة هذا الاختبار يمكن زرع بيليه في أقل من 5 دقائق لكل عين.
المقدمة
عملية تكوين الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة تشكل تلك الموجودة مسبقا، معقد للغاية وينظم من قبل العديد من العوامل الداخلية التي تتحكم في الخطوات المختلفة لتنتشر السفن والتشكل. يتم تشغيل الأوعية الدموية بسبب حدوث تحول في التوازن بين العوامل المؤيدة والمضادة للعائية، وهو التوازن الذي يحافظ عادة على الأوعية الدموية في حالة سكون. الأوعية الدموية في البالغين يحدث في بعض الظروف الفسيولوجية مثل أثناء دورة المبيض الأنثوية أو في عمليات إصلاح مثل التئام الجروح وتجديد الأنسجة. ومع ذلك، فإنه هو أيضا السمة المميزة للعديد من الأمراض بما في ذلك الأورام الخبيثة، وظروف المناعة الذاتية والأمراض الالتهابية. اشتراك الأوعية الدموية في....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتعرض جميع البروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات إلى وأقرته اللجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في مستشفى بوسطن للأطفال وتتم وفقا لتوصيات الاتحاد للتقويم والاعتماد من رعاية الحيوان المعملية (AAALAC). تأكد من استخدام أدوات معقمة وtechniqure العقيم أثناء تنفيذ الإجراء.
1. إعداد الكريات
- تزن من 10 ملغ من sucralfate و 60 ملغ من hydron مع ملعقة unbent معقمة. وضع في أنابيب microcentrifuge منفصلة.
- وضع قطعة 1 سم مربع من شبكة إلى ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وتظهر نتائج نموذجية لbFGF وVEGF في الكريات العادية منخفضة عائية C57BL / 6J الفئران في الشكل 2A و B على التوالي. يبين الشكل 2E التوزيع الطبيعي من منطقة السفينة (VA) في C57BL / سلالة 6J بجرعات متفاوتة من هذه نمو العوامل. 80 الكريات bFGF نانوغرام يؤدي عادة في VA حوالي 2.0 ملم 2، على الرغم من القيم في مجموعة من 1.8-2.4 ملم 2 مقبولة. تسبب 200 نانوغرام الكريات VEGF عادة استجابة من حوالي 0.7 ملم 2، مع مجم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك العديد من الخطوات الهامة في إجراء فحص القرنية ناجحة. أول من صنع كريات موحدة قادرة على أن تزرع وتحفيز الأوعية. أهم أجزاء من إعداد بيليه هي 1) باستخدام عامل النمو خالية من الناقل. 2) ضمان وجود مزيج جيد من عامل النمو مع sucralfate وhydron و3) تحريك الخليط النهائي بسرعة ولكن بعناية من أنبوب إيبندورف للشبكة حيث يلقي الكريات. يوصى ببذل الكريات "زائف" من دون عامل النمو لممارسة هذه التقنية. يجب أن تظهر الكريات البيضاء وطباشيري ويكون مربع تقريبا في الشكل. ينبغي استبعاد أي ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نشكر كريستين جونسون لعمل الرسوم البيانية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| القسم 1: تحضير | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (المعروف أيضا باسم Poly (2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| عوامل النمو: | يجب أن تكون خالية من الناقل (بدون ألبومين مصل بقري (BSA)) | ||
| ؛ عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) | أنظمة R D | # 293-VE-050 / CF | |
| 35 مم طبق | Becton-Dickson | # 353001 | يستخدم لتخزين الكريات |
| طبق بتري 10 سم | VWR | # 25384-342 | يستخدم كسطح عمل لتحضير الكريات |
| شبكة | سفر أمريكا | # 03--300/51 | 300 um nitex النايلون, مقطعة إلى قطع مربعة سم ومعقمة في الأوتوكلاف |
| ملاعق | فيشر العلمية | #21-401-10 | استخدم نهاية مدببة لواحد لتفتيت خليط الحبيبات. ثني نهاية مدببة من أخرى للمساعدة في إزالة الخليط من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة | فيشر العلمية | # 05-408-146 | واحد للهيدرون ، واحد |
| لملقط المجوهرات ، # 5 | Ambler Surgical | #2315E | تحتاج إلى 2 لسحب شبكة |
| مبخر الطرد المركزي | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| القسم 2: الزرع الجراحي للكريات | |||
| مجهر التشغيل | Zeiss | ||
| 2.5٪ Avertin | مخدر عام | ||
| Proparacaine hydrochloride محلول العيون 0.5٪ | Falcon | NDC # 6131401601 | مخدر للعين |
| مضاد حيوي ثلاثي مرهم العيون | Bausch Lomb | NDC # 2420878055 | يحتوي على النيومايسين والبولي ميكسين والباسيتراسين |
| ميكروسكين للعيون ، 5 مم | Surgistar | # 924501 | زاوية 30 درجة |
| سكين فون جريف | Ambler الجراحي | #3401E | |
| ملقط المجوهرات ، # 1 | Ambler الجراحي | #2301E | يجب أن تكون مخففة بحجر شحذ لتركيب |
| ملقط المجوهرات ، # 5 | Ambler Surgical | #2305E | لالتقاط الكريات ووضعها على العين |
| مقص منحني صغير | Ambler جراحي | #5636E | لتقليم الشعيرات |
| شاش | لنشاف العين بعد البروباراكايين | ||
| القسم 3: تصنيف القرنية العصبية | |||
| 2.5٪ أفيرتين | التخدير | ||
| العام مصباح شق | نيكون | FS-2 | يحتاج إلى عين مع شبكية للمساعدة في القياس |
المراجع
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
