Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Восстановление β-катенина ухудшение

11K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51425

⸱

17 июня 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology and Program in Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center, 2Division of Gastroenterology, Hepatology & Nutrition and Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Vanderbilt Ingram Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Метод описан для анализа деградацию белков с использованием, меченные радиоактивным изотопом и люциферазы-слитые белки в Xenopus экстракта яичного и его адаптации для высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторов деградации белков.

Аннотация

Xenopus Laevis яйцо экстракт является хорошо характеризуется, надежная система для изучения биохимии различных клеточных процессов. Xenopus яйцо экстракт был использован для изучения белкового обмена во многих клеточных контекстах, в том числе клеточного цикла и путей передачи сигнала 1-3. В данном случае описан способ выделения Xenopus экстракт яйца, который был оптимизирован, стимулирующей деградацию критического компонента Wnt пути, β-катенина. Два описаны различные методы для оценки степени деградации белка β-катенина в Xenopus яичного экстракта. Один метод визуально информативным ([35 S]-меченного радиоактивным изотопом белки), а другой более легко масштабируется для высокой пропускной анализов (люциферазы светлячка-меченый слитых белков). Методики, описанные может быть использован, но не ограничиваются ими, оценивать оборот β-катенина белка и определить молекулярные компоненты, способствующие его оборота. Кроме того, Абилность для очистки больших объемов однородной Xenopus экстракта яичного сочетании с количественной и легкому считывания люциферазы с метками белков позволяет эта система, чтобы быть легко адаптированы для высокопроизводительного скрининга для модуляторов деградации β-катенина.

Введение

Xenopus Laevis яйцо экстракт широко используется для изучения многих биологических процессов клеток, включая динамики цитоскелета, ядерной сборки и импорта, апоптоз, убиквитиновой метаболизма, клеточного цикла, передаче сигналов и оборота белка 1-17. Xenopus яйцо система экстракт поддается биохимическом анализе легионом клеточных процессов, потому что экстракт яйцо представляет по существу неразбавленного цитоплазму, содержащую все необходимые цитоплазматические компоненты, необходимые для выполнения этих процессов и позволяют расследование. Большие количества экстракта яичного могут быть получены в свое время для биохимических манипуляций, которые требуют большого количества материала (например, очистки белков или высокопроизводительного скрининга) 18-20. Другим преимуществом является то, что концентрация определенных белков в Xenopus яичного экстракта может быть точно регулировать добавлением рекомбинантного белка и / или immunodepletion из endogтиазом белки в отличие от трансфекции плазмидной ДНК, где экспрессия белка, представляющего интерес трудно контролировать. Кроме того, отсутствие доступных рекомбинантных белков могут быть преодолены путем добавления транскриптов, кодирующих белок, представляющий интерес, пользуясь большой емкости свежеприготовленного Xenopus яйцо сухих веществ перевести экзогенно добавленные мРНК.

Регулирование деградации белка имеет решающее значение для борьбы со многими клеточных путей и обрабатывает 21. Xenopus яйцо экстракт широко используется для изучения деградации белка, так как система позволяет несколько способов мониторинга белкового обмена, не смешивая влияния транскрипции и трансляции. Сигнальный путь Wnt является высоко консервативным сигнальный путь, который играет важнейшую роль в развитии и болезней. Оборот β-катенина, основной эффектор пути Wnt, является объектом жесткого регулирования, и увеличение установившегося состоянии ДEvel из β-катенина имеет решающее значение для активации Wnt генов-мишеней. Важность деградации β-катенина выделен тем, что мутации в пути Wnt, которые ингибируют деградацию β-катенина, найденного в ~ 90% всех спорадических случаев колоректального рака 22. Деградация β-катенин компонентами пути Wnt может быть точно воспроизводятся в Xenopus яйца экстракта изучить механизм его оборота, а также для идентификации новых низкомолекулярные модуляторы его деградации 2, 19, 20, 23-29.

Методы подготовки Xenopus яичного экстракта для изучения клеточного цикла были описаны в предыдущих Юпитера публикаций 30-32. Нынешний протокол описывает модификацию этих методов и оптимизирован для деградации [35 S]-радиоактивно β-катенин и люциферазы с метками β-катенин вXenopus яйцо экстракт. Радиоактивно деградация анализ позволяет для прямой визуализации уровня белка через авторадиографией. [35 S]-метионина включена в интересующего белка с использованием реакции перевода в пробирке, который затем может быть непосредственно добавлен к реакции деградации. Кроме того, анализ радиоактивно оборот белок не требует антитело против белка, представляющего интерес эпитопа или тег, который может влиять на стабильность белка. Потому что даже небольшие изменения в уровнях белков, как это отражено в изменениях в интенсивности с радиоактивной полосы белка, легко визуализируются авторадиографией, [35 S]-радиоактивно деградация анализ представляет собой очень полезный способ визуализации оборота белка 2.

Слияние β-катенина в люциферазы светляков (далее по тексту просто «люциферазы") позволяет точно и легковесных количественных измерений уровней белка, для того,для определения кинетических свойств β-катенина оборота 19, 20. Основным преимуществом люциферазы в том, что он обеспечивает прочную количественную систему, которая легко масштабируется вверх. Следующий протокол предоставляет простые способы анализа деградации β-катенина и устойчивой, эффективной и эффективный способ для высокопроизводительного скрининга новых β-катенина модуляторов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка Xenopus Egg Extract

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый лягушка дает около 1 мл полезной экстракта яиц. Экстракты из 10 лягушки обычно получают за один раз, а объем буфера, описанного ниже, для выполнения 10 лягушки Xenopus экстракт яйцо преп. Объем буфера может быть соответствующим образом скорректированы для больших или меньших препаратов экстракта яиц. Preps, полученные таким образом последовательно дают концентрации белка ≥ 50 мг / мл. Процесс сбора яиц и их переработке в экстракте наиболее эффективен, когда проводится два человека. (Для основных методов лягушка животноводства см. Sive др.. 33).

  1. Яйцо Коллекция
    1. Для премьер-лягушки, придать каждой самки лягушки с 100 U беременных Маре сыворотки гонадотропин (PMSG) из свежеприготовленного 250 Ед / мл складе. Используйте 3 мл туберкулиновые шприцы с 27 G иглы для введения подкожно, со скосомигла вверх, в спинной лимфатический мешок, который находится примерно в 1 см от средней линии от зубчатых обесцвечивания по длине ног лягушки.
    2. Храните праймированные лягушки в воде (плюс 20 мМ NaCl, см. Sive др.. 33) при 18 ° С в течение 5-10 дней. Для стоя резервуаров от воды, плотность животных составляет около 4 л воды на женской лягушки. ПРИМЕЧАНИЕ: минимальное время, необходимое для грунтования вступили в силу 5 дней, и последствия грунтовки стираться через 10 дней.
    3. Подготовка Modified Звонки (MMR) решение 0.5x Марка, от MMR складе 20x. 20x MMR состоит из 2 М хлорид натрия, 40 мМ хлорида калия, 40 мМ хлорида кальция, 20 мМ хлорид магния, и 100 мМ 4 - (2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-кислоту (HEPES), рН 7,4.
    4. Настройка ведра для всех вводимых лягушек (одна лягушка за 4 L ведро). ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на более чем один лягушка может быть размещен в том же ведро для сбора яиц, если один из лягушеклежит преимущественно низкого качества яиц, значительное количество усилий потребуется, чтобы отделить низкого качества яйца от тех, которые подходят для изготовления экстракта. Таким образом, максимальное количество лягушек в одном танке, чтобы свести к минимуму количество буфера, используемого для яйца собирать не стоит риска.
    5. Введите 750 U хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) в спинной лимфатический мешок каждого лягушки с помощью иглы 27 G, как описано в 1.1.1.
    6. Поместите каждый из HCG впрыском лягушек на отдельные 4 L ведрах 0.5x MMR охлаждают до 16 ° С.
    7. Поместите контейнеры с лягушек в инкубаторе 16 ° C, чтобы собирать яйца O / N (15-16 ч). ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание нужной температуры имеет решающее значение для всей процедуры, от сбора яйца подготовке экстракт яйца.
  2. Dejellying яйца
    Примечание: Яйца покрыты студенистой оболочки, которые должны быть удалены до подачи экстракта. Вероятность спонтанного лизиса яиц увеличивает как время betweeн откладки яиц и извлечь подготовки увеличивается. Таким образом, важно, чтобы пройти через следующие шаги как можно быстрее.
    1. Подготовка 4 л 1x MMR, 50 мл 0,1 × MMR, и 400 мл 2%-цистеин, рН 7,7, выполненный в дистиллированной воде. Поддерживать все решения при 16 ° C.
    2. Чтобы изгнать дополнительные яйца, слегка сжать нижней части спины и живота лягушки.
    3. Удалите лягушек и большую часть MMR, чтобы оставить яйца в примерно 1-200 мл MMR в каждом сегменте.
    4. Удалите мусор с пипетки, и оценить качество яиц: высокое качество яйца, как правило, характеризуется четким разделением между мрачно пигментированных полушарии животных и слегка окрашенной вегетативного полушария и имеют самый высокий темный-свет контраст. Откажитесь с пипетки любые яйца, которые появляются тягучий, пестрый, или лизируют (белый и пухлыми), как они будут уменьшать общее качество экстракта. Если> 10% яиц имеют низкое качество, всяпартия должна быть отброшена.
    5. Комбинат яйца в стеклянный стакан 500 мл и вылейте столько MMR, насколько это возможно, сохраняя при этом яйца под водой.
    6. Промойте яйца, осторожно закрученной дважды объема яиц из MMR. Повторите дважды, и удалить любой мусор или явно низкого качества яиц.
    7. Добавить примерно в 100 мл 2% цистеина в стеклянный стакан, вихревой нежно смешать, и позволяют яйца урегулировать в течение 5 мин при 16 ° C. Слейте цистеин. ПРИМЕЧАНИЕ: Dejellying отмечен постепенном появлении желе пальто плавающих над яйцами и более компактной упаковки яиц, поскольку они в настоящее время занимают меньший объем без студенистой оболочки.
    8. Добавить еще 100 мл 2% цистеина, нежно вихревой, подождите 5 мин, а затем медленно вылейте цистеин. Повторите, пока яйца не стали плотно спрессован (обычно на третьей обработки цистеина). Примечание: Если яйца слишком долго в цистеина, они склонны к лизису. Точно так же, dejellied яйца являются хрупкими и склонными к механическим лизиса, если оникоторые кружились слишком энергично или если они подвергаются воздействию воздуха. Как только яйца были dejellied, важно, чтобы быстро перейти к стадиях центрифугирования.
    9. Вылейте цистеин, и смыть желе пальто и другой мусор, аккуратно мыть яйца в 1x MMR. Выливают буфер осторожно вдоль стороны стакана. Повторяйте дважды или до решения MMR уже не дождь. В то время как промывка 1x MMR продолжать удалить плохие яйца с использованием передачи пипетки.
    10. Выполните окончательное нежный промыть 30 мл 0,1 × MMR, и аккуратно слейте как можно больше буфера, как это возможно. Опять же, удалите все очевидно плохие яйца.
  3. Упаковка и Дробление яйца путем центрифугирования
    Примечание: экстракт описано ниже, который используется для деградации β-катенина является вариантом цитостатического фактора экстракта (метафазы II-задержан). В отличие от низкой скорости и высокой скоростью экстракта, используемого для исследований клеточного цикла, экстракт промежуточного скорость лучше всего подходит для деградации β-катенина. Яnterphase экстракт же способствует надежной деградации β-катенина хотя более трудоемок, чтобы подготовиться.
    1. Добавить лейпептина пепстатина апротинина смесь (LPA, ингибитор протеазы) при 10 мкг / мл (разбавленных с 10 мг / мл маточного раствора в ДМСО) и цитохалазином D при 20 мкг / мл (разбавленных с 10 мг / мл маточного раствора в ДМСО) в оставшиеся 20 мл 0,1 × MMR.
    2. Добавить 0. Х MMR содержащий МПУ и цитохалазином D к промытым яиц, вихревой нежно и инкубировать 5 мин при 16 ° C.
    3. Трансфер яйца на 16 ° C до охлажденных 50 мл центрифужные пробирки, позволяют яйца осесть и удаления остатков буфера сверху. Для предотвращения воздействия воздуха, снять небольшое количество буфера в пипетку до снятия яйца для передачи. Продолжить передавать дополнительные яйца в центрифужные пробирки и удалить остаточный буфер из верхней части трубки пока яйца заполнить центрифужную пробирку на вершину, которая будет максимизировать выходизвлечь.
    4. Чтобы упаковать яйца, спин центрифужные пробирки при 400 мкг в течение 60 сек при 4 ° С с использованием ротора фиксированный угол. Удаление остаточного буфера из верхней части центрифужных пробирок.
    5. Для дробления спина, спина пробирки при 15000 мкг в течение 5 мин при 4 ° C.
  4. Сбор цитоплазматических слой экстракта
    Примечание: Метод, описанный ниже отличается от классического метода выкалывания сторону центрифужную пробирку для сбора цитоплазматический слой. Этот протокол был адаптирован для упрощения и для использования с конкретным центрифужных пробирок, которые повторно. Нет заметные различия в кинетике деградации β-катенина не будут найдены при любом способе. В этот момент выписки следует держать в холоде в течение в течение всего процесса, и все шаги должны быть выполнены при 4 ° С.
    1. Очистите отверстие в липидного слоя с использованием P1000 пипетки.
    2. Сбор цитоплазматический слой (между темной пигментного слоя и Liнравом липидный слой), используя новый наконечник P1000 пипетки в чистые предварительно охлажденных центрифужные пробирки (рис. 1). Для экстракта высококачественного что ухудшает надежно β-катенин, свести к минимуму количество пигментированных и липидный слой, который снят с цитоплазматической слоя.
    3. Спин экстрагируют цитоплазматический слой при 15000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и снова собрать цитоплазматический слой. Повторите отжима и экстрагирования 1X. ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракт должен быть "соломенного цвета." Если есть значительное загрязнение с пигментными и липидных слоев в этот момент, можно повторить спина еще раз, хотя чрезмерное спины снизится способность экстракта разрушать β-катенин.
    4. Добавить LPA и цитохалазином D выписке в конечной концентрации 10 мкг / мл каждый. Примечание: С использованием метода, описанного дает довольно последовательную общую концентрацию белка примерно 50 мг / мл (52,41 ± 5,40 мг / мл, N = 3 отдельных Preps) в Xenopus например,г экстракты.
    5. (Дополнительно) Для перевода анализов, добавить увенчанный мРНК (0,1 мг / мл), Rnasin (1,5 ед / мл), и энергия микс регенерации (2.2.1) и инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение 2 часов (для получения дополнительной информации см. Salic ET аль. 2 и Sive соавт. 33). Немедленно Используйте переведенный экстракт для β-катенина анализов деградации или оснастке замораживания в жидком азоте для последующего использования. ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеприготовленный экстракт имеет высокую способность переводить экзогенно добавленную мРНК, но, к сожалению, эта способность теряется, как только экстракт заморожены. Сборную мРНК могут быть легко получены с использованием коммерчески доступных наборов.
    6. Экстракт мгновенного замораживания в жидком азоте. ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракты хранятся в небольших (200 мкл) аликвоты для одноразового использования, потому что они быстро теряют способность разрушать β-катенин, если замораживать. Для длительного хранения, экстракт можно хранить в жидком азоте. Для кратковременного хранения, экстракт можно хранить при -80 ° С, хотя емкость оЭкстракт е деградировать β-катенин можно резко сократить с длительного хранения при температуре -80 ° С (более чем на 2 месяца).

2. Подготовка экстракт для β-катенина деградации Пробирной

  1. Истощение от Xenopus Extract
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основным преимуществом экстракта Xenopus является способность легко истощить компоненты пути и точно добавить обратно определенное количество белка, чтобы определить свои дозозависимых эффекты.
    1. Используйте свежеприготовленные Xenopus яичный экстракт или быстро размораживайте экстракт и место на льду. Выполните все манипуляции в холоде.
    2. Добавить экстракт в 1/10 объема гранулированного аффинности антитела или шариков (например, 20 мл осаждали шариков 200 мл) экстракта. Чтобы свести к минимуму разбавление экстракта, снять столько жидкости из шариков, как это возможно перед добавлением экстракта с помощью гель советы загрузки с длинными коническими концами.
    3. Поверните экстракт-шарик смесь при 4 ° С в течение 1 часа.
    4. Спин экстракт-шарик смесь на 12 600 мкг в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 30 сек. С другой стороны, если используются магнитные шарики, применять магнитное поле для сбора шариков.
    5. Передача обедненный экстракт свежего пробирке на льду. Будьте осторожны, чтобы не передавать любые бусы с экстрактом.
    6. Подтверждение эффективности истощения иммуноблоттингом как обедненный экстракта и бусы.
    7. Подготовка экстракт для β-катенина деградации анализа, как описано в п. 2.2.
  2. Оптимизация Xenopus Выписка для β-катенина деградации
    ПРИМЕЧАНИЕ: деградация β-катенин в Xenopus яичного экстракта является энергетически зависимым процессом, который быстро истощает эндогенные АТФ магазинов. Следовательно, система регенерации энергии требуется для поддержания надежной деградации β-катенина.
    1. Подготовьте 20x регенерации энергии (ER) смесь, состоящую из 150 мМ креатинфосфата, 20 мМ АТР, 600 мкг / мл креатинфосфокиназы,и 20 мМ MgCl 2. ER следует аликвоты и хранили при -80 ° С. Избегайте повторных циклов замораживания / оттаивания, используя небольшие замороженные аликвоты.
    2. Быстро разморозить Xenopus яичный экстракт, потерев замороженный трубку между руками. Поместите пробирку на льду перед все из экстракта растает.
    3. Добавить 10 мкл регенерации энергии смеси (20x ER) в аликвоты (200 мкл) Xenopus яичного экстракта. Тщательно перемешать, переместив палец вдоль трубки и импульса вихревание. Пульс-спин и сразу разместить на льду.
    4. (Опционально) Оборот β-катенина может быть слегка повышена в Xenopus яйца экстракта добавлением убиквитином (1,25 мг / мл конечного). Циклогексимид (0,1 мг / мл окончательный) также могут быть добавлены к минимуму перевод эндогенных транскриптов.
    5. Алиготе соответствующие объемы для деградации анализа в предварительно охлажденной микроцентрифужные пробирки на льду. Для меченных анализов деградации β-катенин, снять 2-5 мл извлечь для каждого момента времени.

3. Radiolabeled β-катенин деградация анализ в Xenopus яичного экстракта

Примечание: Все шаги должны быть выполнены на льду если не указано иное.

  1. Подготовка радиоактивно меченные β-катенин
    1. Подготовка недавно в пробирке синтезированных [35 S] метионин радиоактивно белка с использованием коммерчески доступных наборов. Примечание: Генерирование 35 S-меченого (период полураспада 87 дней) белки легко и эффективно произведено с использованием коммерчески доступных пробирке связью наборы транскрипции-трансляции в. Важно, что в переводе белка достаточно помечены таким образом, что изменения в оборот белка можно легко визуализировать.
    2. Для подтверждения успешного радиоактивной, выполните SDS-PAGE/autoradiography с 0,5 мкл переведенного белка. Количественная оценка интенсивности меченного β-катенина полосы, с использованием ImageJ, ImageQuant, или альтернативный количественный программного обеспечения прогря. ПРИМЕЧАНИЕ: радиоактивно полоса белка β-катенин должен быть отчетливо виден на пленке в течение нескольких часов (4-6 ч).
    3. Snap-не заморозить меченого белка в жидком азоте для хранения до использования. Примечание: Длительное хранение (> 2 месяцев) и несколько замораживания / оттаивания (больше 2) может серьезно повлиять на способность меченного β-катенина ухудшить решительно в Xenopus яичного экстракта. Как правило, стабильность меченых белков значительно снижается после 1 месяца хранения при -80 ° С; Таким образом, относительно свежеприготовленный радиоактивно β-катенин дает лучшие результаты в этих деградации анализов.
  2. Выполнение β-катенина деградации Пробирной
    1. Добавить 1-3 мкл (в зависимости от силы сигнала радиоактивно полоса) в пробирке-переведенного β-катенина (и других белков, небольшие молекулы и т.д., которые проходят испытания) в 20 мкл реакционной смеси Xenopus на льду. Тщательно перемешать на quicklу щелкая трубки и короткий импульс встряхивания; это важный шаг, как Xenopus яйцо экстракт очень вязкой, и неполное перемешивание повлияет на согласованность результатов. Пульс спин и место на льду.
    2. Запустите β-катенина реакцию деградации путем сдвига труб до комнатной температуры.
    3. В назначенный момент времени, удалить 1-5 мл пробы и сразу же смешать с ДСН буфера для образцов (объем 5x), чтобы остановить реакцию. Чтобы убедиться, что реакция деградации полностью прекращается, Флик трубку несколько раз, и вихрь энергично.
    4. Выполните SDS-PAGE/autoradiography. Запуск 1 мл эквивалентов (~ 50 мг белка) экстракта для каждого момента времени / пер. Деградация β-катенина в Xenopus яичного экстракта следует свидетельствует нестационарной снижению интенсивности меченого β-катенина группы рисунке 2. Количественная результаты, используя ImageJ, ImageQuant, или другое программное обеспечение предпочтительным изображений, если необходимо.
    5. (Опортогональной) замочить в SDS-полиакриламидном геле в фиксирующем растворе (10% уксусной кислоты и 30%-ный метанол в дистиллированной воде) перед сушкой, чтобы уменьшить фон радиоактивности и повысить качество изображения.

4. Β-катенин-люциферазы Деградация Анализ в Xenopus Egg Extract

Выполните все шаги на льду если не указано иное.

  1. Подготовка β-катенина-люциферазу
    1. Обобщить не-меченого, люциферазы с метками β-катенин помощью транскрипции-трансляции связанную систему с полной смеси аминокислот.
    2. Подтверждение производство люциферазы с метками β-катенина путем измерения активности люциферазы от 0,5-1 мкл реакции. Оценка фонового свечения путем измерения люминесценции от нетранслируемом реакционной смеси. ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько коммерческие наборы доступны для измерения активности люциферазы. Долгоживущих люминесценции, однако, особенно хорошо работает для деградации Ассау.
  2. Выполнение β-катенин-люциферазы деградации Пробирной
    1. Оттепель и подготовить Xenopus яичный экстракт, как в п. 2.2.
    2. Добавить в пробирке-переводится β-катенин-люциферазы слияние (от 4,1) в подготовленную Xenopus реакционной смеси (от 2.2) на льду и хорошо перемешать как в 3.2.1. Примечание: активность β-катенина люциферазы, который добавляется к экстракту, как правило, между 20 - 50000 относительные единицы люминесценции (RLU) / мл экстракта (на основе измерений, полученных от 4.1.2). Пусковой сигнал должен быть примерно 100 000 РОС (2-5 мл в пробирке-переведенного β-катенина-люциферазы синтеза).
    3. Сдвиг выписку до комнатной температуры Для начала реакции деградации.
    4. Удалить аликвоты реакции в указанное время и оснастки заморозить в жидком азоте. Примечание: трех образцов обычно удаляются для анализа для каждой временной точке. Замороженные экстракт можно хранить при -80 ° C ЕНТиль они готовы для анализа.
    5. Образцы оттепели лед, передает пробы в стандартных белых 96-луночных планшетах на льду, и процесс активности люциферазы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема деградации β-катенина в Xenopus яичного экстракта показано на фиг.2А. 35 S-меченого β-катенин инкубировали в Xenopus яичного экстракта аликвоты (1 мл экстракта эквивалент) были удалены в соответствующие моменты времени, и образцы подвергали SDS-PAGE с последующим авторадиографии. деградации β-катенина компонентами пути Wnt опосредуется системой убиквитин-протеасом 2, и деградация [35 S]-меченного β-катенина в экстракте Xenopus ингибируетс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Xenopus яйцо экстракт является надежным биохимическая система для исследования оборот β-катенина. Концентрация β-катенина в Xenopus яичного экстракта составляет ~ 25 нМ 2. При оптимальных условиях, экстракт яйцо способен разлагать β-катенин со скоростью 50-100 нм / ч и составляет половину от максимального при 200 нм 24. Есть несколько важных шагов для успешного восстановления деградации β-катенина с использованием Xenopus яйцо экстракта. К ним относятся: 1) формирование в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Мы благодарим Лори Ли за критическое прочтение рукописи. TWC поддерживается в Американской ассоциации сердца Predoctoral Fellowship (12PRE6590007). MRB поддерживается учебного гранта Национального института рака (T32 CA119925). SSH поддерживается Национальных Институтов Здоровья (R01DK078640). EL поддерживается Национальными Институтами Здоровья (R01GM081635 и R01GM103926).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гонадотропин сыворотки крови беременной кобылы (PMSG)ProSpechor-272-AВосстановленный дистиллированной водой перед применением.
Хорионический гонадотропин человекаSigmaCG10-10VL
Хлорид калияFisherBP366-1
Хлорид натрияResearch Products InternationalS23020-5000.0
Хлорид магнияFisherBP214-500
Хлорид кальцияAcros OrganicsAC42352-5000
HEPESFisherBP310-1
ЦистеинAcros OrganicsAC17360-1000
ЛеупептинSigmaL2884-10MG
АпротининSigmaA1153-10MG
ПепстатинSigmaP4265-5MG
Цитохалазин BSigmaC8273-10MG
3 мл шприц: Luer Lock tipBecton Dickinson309657
27 G иглаBecton Dickinson305109
96 лунок твердая белая полистирольная микропластина, круглое дноCorning3605
Steady-Glo люциферазная системаPromegaE2520Хранить долгосрочно при -80 ° C, может храниться до 1 месяца при -20 °°; C
TNT Sp6 связанная система лизата ретикулоцитовPromegaL4600
TNT Sp6 высокоурожайная система экспрессии белка зародышей пшеницыPromegaL3260Как правило, более высокий выход, чем у лизата ретикулоцитов 
Смесь для мечения белка EasyTag Express [S35]Perkin ElmerNEG772007MC
КреатинфосфатSigma27920-5G
АТФSigmaA2383-5G
КреатинфосфокиназаSigmaC3755-35KU
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD8418-50ML
Системаанализа люциферазы Dual-GloPromegaE2920Те же условия хранения, что и у Steady-Glo
50 мл Центрифуга ПробиркиFisher Scientific0556214D
Sorvall SS-34 с фиксированным угломThermo Scientific28020
115 В 50/60 Гц МиницентрифугаFisher Scientific05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kitAmbionAM1340
Anti-firefly антитело к люциферазеAbcamab16466
Anti-GSK3 антителоBD Transduction Laboratories610201
FLUOStar OptimaBMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus центрифугаThermo Scientific
16 ° C ИнкубаторPercival Scientific
наклона

Ссылки

  1. Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
  2. Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
  3. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
  4. Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
  5. Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
  6. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
  7. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  8. Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
  9. Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
  10. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  11. Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
  12. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  13. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  14. Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
  15. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  16. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
  17. Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
  18. Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
  19. Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
  20. Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
  21. Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
  22. Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
  23. Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
  24. Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
  25. Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
  26. Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
  27. Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
  28. Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
  29. Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
  30. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  31. Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
  32. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  34. Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
  35. Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
  36. Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
  37. Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:

2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.

2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled β-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.

3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.

3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of β-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled β-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.

4.2.2. Add in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the β-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion).

to:

2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 µl pelleted beads to 200 µl extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.

2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled β-catenin degradation assays, withdraw 2-5 µl extract for each time point.

3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 µl of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.

3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 µl equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of β-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled β-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.

4.2.2. Add in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the β-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/µl of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 µl of the in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion).

Теги

Деградация бета-катенинабесклеточная системарадиоактивное мечениелюциферазный анализингибирование протеасомыингибирование GSK3иммуноблоттингсмесь для регенерации энергиивысокопроизводительный скрининг
Восстановление β-катенина ухудшение
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.