质谱成像（MSI）是一种强大的工具，可用于在完整组织中发现和鉴定多种化学物质，同时将化合物保留在其原始环境中，从而为生物学过程提供新的见解。本文介绍了一种用于小分子分析的质谱成像方法。
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本文内容
摘要
摘要
研究小分子（如药物或内源性代谢物）的大多数技术均采用组织提取物，这需要对目标组织进行匀浆处理，而该过程可能导致所研究的代谢通路发生变化1。质谱成像（MSI）是一种强大的分析工具，可提供生物组织切片中分析物的空间分布信息1-5。该技术已被广泛用于研究多种化合物，包括蛋白质、多肽、脂质以及内源性代谢物等小分子。利用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）-MSI，可同时检测多种代谢物的空间分布。本文介绍了一种专为豆科植物根部及根瘤开展非靶向代谢组学MSI实验而开发的方法，该方法有助于揭示其中发生的生物学过程。本文所述方法展示了一个典型的MSI工作流程，从样本制备到图像采集，并重点介绍了基质涂布步骤，演示了多种适用于小分子检测的基质应用技术。在生成质谱图像后，进一步讨论并演示了目标代谢物的分析与鉴定过程。此处介绍的标准工作流程可根据不同组织类型、分子种类和仪器设备进行简便调整。
引言
代谢组学这一新兴领域具有诸多重要的生物学应用，包括生物标志物的发现、解析植物及其他生物系统中的代谢通路，以及毒理学谱型分析4,6-10。研究生物系统时面临的一个主要技术挑战是在不干扰代谢过程的前提下对其代谢组通路进行研究11。基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）可实现对完整组织的直接分析，从而在单个器官12,13甚至单个细胞14,15水平上对分析物进行高灵敏度检测。
样品制备是生成可重复且可靠的质谱成像结果的关键步骤。图像质量在很大程度上取决于组织包埋介质、切片厚度、MALDI基质以及基质施加技术等因素。在成像应用中，理想的切片厚度为单个细胞的宽度（根据样本类型不同，约为8–20 µm）。MALDI需要在样品表面沉积一种有机结晶基质化合物，通常为弱酸，以辅助分析物的脱附和离子化过程16。不同的基质会为不同类别的化合物提供不同的信号强度、干扰离子以及离子化效率。
基质施加技术也会影响质谱成像的质量，不同类型的分析物适用于不同的施加方法。本实验方案介绍了三种基质施加方法：喷枪法、自动喷涂仪法和升华法。喷枪法基质施加在MALDI成像中已被广泛使用。其优点是相对快速且操作简便。然而，喷枪法施加基质的质量在很大程度上依赖于操作者的技能，通常可重复性较差，并容易引起分析物扩散，尤其是小分子分析物17<....
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方案
1. 仪器设备
- 基质辅助激光解吸电离飞行时间/飞行时间质谱成像（MALDI-TOF/TOF MSI）。使用配备MALDI源的质谱仪分析小分子（参见材料/设备表）。根据目标分析物选择正离子或负离子模式进行检测。设定目标质荷比范围，在样品表面沿x和y方向以50 µm间距采集每个像素点500次激光脉冲，以生成离子图像。可根据需要调整光栅宽度和激光脉冲次数，以分别获得更高的空间分辨率和最大信号强度。使用涂布于载玻片或直接施加于组织上的DHB基质峰或内标物对质谱数据进行质量校准。
- 高分辨液相色谱-质谱（LC-MS）。（参见材料/设备表）根据目标分析物的不同，采用反相（RP）C-18色谱柱或正相（NP）HILIC色谱柱，结合液相色谱-质谱法分析样品提取物。根据具体样品类型选择合适的流动相及梯度程序。根据样品类型选择正离子或负离子模式进行检测。
2. 组织制备
- 从植株上剪下根瘤，保留3-4 mm的根段与根瘤相连。
- 解剖后立即用镊子将组织放入冷冻切片杯中，并用明胶（去离子水中100 mg/ml ）覆盖。必须确保组织牢固贴附于杯底 ，且无气泡存在。
- 将切片杯置于干冰/乙醇浴中快速冷冻，直至明胶硬化并变为不透明状态。将样品储存于-80 °C直至使用。
- 从-80 °C冰箱中取出样品，去除塑料冷冻切片杯，....
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结果
MSI 实验概述如图1所示。实验最开始的关键步骤是样品制备。将根瘤从植物根部切下并包埋于明胶中。在冷冻过程中，必须将组织紧贴低温恒温器杯底压平，不得产生气泡；这将有助于切片时组织的准确定位与整齐排列。在切片过程中，控制切片厚度至关重要：切片过薄会导致组织撕裂，破坏组织完整性；而切片过厚则会降低从组织中提取和检测到的分析物数量。基质的选择及其涂布方法将决定所检测分析物的种类。采用多种基质组合可获得互补的结果。本文介绍了三种基质涂布技术：喷雾法速度快，但由于分析物扩散，通常不适用于小分子的质谱成像；自动喷涂系统和升华法可形成更小的基质晶体，重现性更好，且分析物扩散更少。图2展示了Medicago truncatula根瘤切片的光学图像。图3分别展示了使用喷雾法、自动喷涂系统和升华法时基质覆盖情况及晶体大小的光学图像示例。
传统的基质（如DHB）会在低质荷比范围（m/z 100–400）内产生大量离子20，这些基质离子可能干扰该范.......
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讨论
如上所述，样品制备是质谱成像（MSI）工作流程中最关键的步骤。组织包埋不均匀会导致切片困难，甚至在某些情况下无法进行切片。切片尺寸和充分的平衡时间对于维持组织完整性、避免折叠和撕裂至关重要。基质的选择及其涂布方法将影响可检测分析物的种类、空间分辨率以及结果的重复性。联合使用多种基质或不同的涂布技术可能获得互补的结果。
该方法专为内源性代谢物的非靶向质谱成像而设计 M. truncatula 根瘤组织，但也可轻松适用于其他组织类型和生物学问题。小分子质谱成像（MSI）推荐的基质施加方法为升华法和自动喷涂法。通过调整自动喷涂法增加沉积在组织上的溶剂量，可提高分析物的提取效率，从而有助于检测较高分子量的化合物；若进行脂质、肽类的质谱成像，此方法尤为适用。 等等使用其他类型的组织时，主要调整在于切片厚度。理想情况下，组织应被切成单个细胞的厚度；因此，植物组织可能需要较厚的切片，而动物组织则可能需要较薄的切片。如果出现折叠或撕裂现象，通常需要在切片前延长平衡时间，或采用较厚的切片厚度。在进行液相色谱-质谱联用（LC-MS）以获得准确质量数时，可根据目标分析.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢威斯康星大学麦迪逊分校农学系的 Jean-Michel Ané 博士提供截形苜蓿（Medicago truncatula）样品。本研究部分由美国国家科学基金会（NSF）资助项目 CHE-0957784、威斯康星大学研究生院、威斯康星校友研究基金会（WARF）以及 Romnes 教师研究奖学金项目（授予 L.L.）提供支持。E.G. 获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1256259）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 明胶 | Difco | 214340 | 加热至溶解 |
| 冷冻切片机- HM 550 | 赛默飞世尔科技 | 956564A | |
| 氧化铟锡（ITO）镀膜玻璃载片 | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm × 75 mm × 0.8 mm（宽 × 长 × 厚） |
| 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质 | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| 喷枪 | Paasche Airbrush Company | TG-100D | 与75 ml钢制容器联用 |
| 自动基质喷涂系统 - TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | 仪器安装时将提供具体的启动和关闭说明 |
| 升华装置 | Chemglass生命科学 | CG-3038-01 | |
| 真空泵 - Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | 极限压力 = 1 × 10-4 托 |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | 布鲁克·道尔顿 | 276601 | |
| FlexImaging | 布鲁克·道尔顿 | 269841 | 一个例子是 "特定供应商软件" |
| MALDI LTQ Orbitrap | 赛默飞世尔科技 | IQLAAEGAAPFADBMASZ | 用于精确质量测定的高分辨率 MALDI 仪器 |
| Q Exactive | 赛默飞世尔科技 | IQLAAEGAAPFALGMAZR | 用于精确质量测定的高分辨率液相色谱-质谱联用仪 |
参考文献
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217....
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重印与许可
