Два Методы Создание первичных клеток человека эндометрия стромальных от гистерэктомии образцов

Summary

Создание первичных эндометрия системы стромальных клеточных культур от гистерэктомии образцов является ценным биологическим техника и решающим шагом до проводит широкий спектр исследований направлена. Здесь мы описываем два методы, используемые для установления стромальных культур из хирургически удаленных эндометрия тканях больных людей.

Abstract

Много усилий было посвящено установить в пробирке системах клеточных культур. Эти системы предназначены для моделирования огромное количество естественных условиях процессов в. Клеточные культуры системы, вытекающие из эндометрия образцов человека не являются исключением. Область применения простирается от нормальных циклических физиологических процессов в эндометрии патологий, таких как гинекологического рака, инфекционных заболеваний, а также репродуктивных недостатков. Здесь мы предоставляем два метода для создания первичных эндометрия стромальных клеток из хирургически удаленных эндометрия гистерэктомии образцов. Первый метод называют "методом очищающего" и включает в себя механическое выскабливание с помощью хирургических или бритвенных лезвий в то время как второй метод называют "метод трипсин". Этот последний метод использует ферментативную активность трипсина, чтобы способствовать отделению клеток и первичных клетки вырост. Проиллюстрируем шаг за шагом методологии с помощью цифровых изображений и микроскопии. Мы также Providпримеры е для проверки эндометрия линии стромальных клеток с помощью количественных реального времени полимеразной цепной реакции (КПЦР) и иммунофлюоресценции (ИФ).

Introduction

Человеком матки корпус состоит из трех слоев, в периметрий (или серозной), миометрия и эндометрия. Отличительные каждый из этих слоев является важным шагом для установления эндометрия клеточных линий. Периметрий является самой внешней слой матки и состоит из тонких, серозных клеток. Миометрия является толстый, средний слой матки и состоит из гладкомышечных клеток. Эндометрий идентифицируется как внутреннего слоя матки и включает эпителиальные и стромальных клеток населения.

Эндометрий далее подразделяется в базального слоя которого стволовых клеток населения Предполагается для повторного заполнения functionalis слой примерно каждый 28 дне....

Protocol

Гистерэктомия образцы, используемые в этой рукописи были собраны в соответствии с Университетом IRB-утвержденным протоколом этики пронумерованных IRB-HSR # 14424.

1. Приобретение Образец от клинической Источник

1. Получить правительство и учреждение на основе этических принципов и документацию утверждения перед началом.
2. Провести все шаги в стерильных условиях.
3. Сохранение пациента, полученных ткани в медиа-среде RPMI (или DMEM с высоким содержанием глюкозы /) в 50 мл пробирку при 4 ° С, если образец не может быть обработан в культуре немедленно. В течение максимум 24 часов Образцы могут храниться в этом состояни....

Results

Как подчеркивается в разделе протокола, обязательно проводить все методы в рамках государственных, институциональных и этических принципов при обращении и подготовки ткани человека.

В эту рукопись является иллюстрацией общего процесса по методу "очищающего" (Фиг.1А) и "метод трипсин" (фиг.1В) используется для установления первичных культур эндометрия. Эти методы подробно описаны в разделе протокола (см. детали 1 -. 3.). Оба .......

Discussion

Другие группы описали и адаптированы методологии для подготовки эндометрия стромальных культур, большинство из которых используют коллагеназы ^{4,12,13,15-18.} В этой рукописи, мы обеспечили методику и доказательства в течение двух упрощенных первичных стромальных эндометрия методов культуры, оба из которых используемых нашей лаборатории по экономическим причинам и удобной доступности трипсина и / или лезвием бритвы.

При сравнении наших двух методов, как успешно генерировать жизнеспо.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 трипсина или 0,05% трипсина	Hyclone	SH3023602 или SH30004202
1,7 микроцентрифужной пробирки	Genesee Scientific	22-272A
1 µ l, 20 и микро; l, 200 мл и 1 000 & микро; l Пипетка	Genesee Scientific	24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 мл Коническая трубка	Hyclone	339650
50 мл Коническая трубка	Гиклон	339652
6 см Чашка для клеточных культур	Термонаучный	12-556-002
8-луночные камеры	Thermo Scientific	AB-4162
Ацетат	Fisher scientific	C4-100
AMV RT Фермент/Буфер	Bio Labs	M077L
Бычья сыворотка альбумин (BSA)	Fisher Scientific	BP-1605-100
Буферный формалин цинка	Термо	59201ZF
Полоса древесного угля FBS	Фишер	NC9019735
Хлороформ	Fisher Scientific	BP1145-1
Чехол слип	Fisher Brand	12-544D
Циклический АМФ (cAMP)	Sigma	B7880
DMEM/Высокий уровень глюкозы	Hyclone	SH30243FS
dNTP	Bioline	BIO-39025
Donkey Anti Goat -TRITC	Santa Cruz	SC-3855
Сыворотка для осел	Джексон s lab	017-000-002
E Антитела к кадгерину	Эпитомика	1702-1
Этанол	Fisher Scientific	BP2818-1
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	Fisher Scientific	03-600-511
Фунгизона амфотерицин B	Gibco	15290-018
Зонд GAPDH	Life Technologies	HS99999905
Гликоген	5Prime	2301440
Козья антимышь - FITC	Джексон Лаборатория	115-096-003
Изопропанол	Fisher Scientific	BP2618-1
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5
Медроксипрогестерона ацетат (МПА)	Sigma	M1629
MeOH (Метанол)	Монтажный материал Fisher Scientific	A4-08-1
(с DAPI)	Векторные лабратории	H-1500
N6 ДНК Олигос	Скребок Инвитроген
No 15	BD	371615
Пан Цитокератин  Мышь mAB	Cell Signaling	4545
PBS (фосфатно-солевой буфер)	Fisher Scientific	BP-399-4
Пенициллин-стрептомицин глутаминовый раствор 100X	Hyclone	SV30082.01
PML Anti Goat Antibody	Санта-Круз	SC-9862
Грунтовка	РПМИ «Еврофинс
»;	Гиклон	SH30027FS
RPMI (без фенола)	Gibco	11835
Sybr Green	Thermo Scientific	AB-4162
Taqman	Термо	АБ-4138
Тризол	Life Technologies	15596018
антитела к виментину	Эпитомика	4211-1