Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

Résumé

L’imagerie en accéléré chez l’animal vivant fournit des informations précieuses sur la réorganisation structurelle du cerveau intact. Ici, nous introduisons une préparation de crâne aminci qui permet l’imagerie transcrânienne de structures synaptiques marquées par fluorescence dans le cortex de souris vivantes par microscopie à deux photons.

Résumé

Dans le cortex des mammifères, les neurones forment des réseaux très complexes et l'échange d'informations au niveau des synapses. Changements dans la force synaptique, ainsi que l'ajout / suppression de synapses, se produisent d'une manière dépendant de l'expérience, fournissant la base structurelle de la plasticité neuronale. Comme composants post-synaptiques des synapses excitateurs plus dans le cortex, épines dendritiques sont considérées comme un bon indicateur de synapses. Prendre avantages de la génétique de la souris et des techniques de marquage par fluorescence, des neurones et de leurs structures synaptiques peuvent être marqués dans le cerveau intact. Ici, nous introduisons un protocole d'imagerie transcrânienne utilisant deux photons microscopie à balayage laser à suivre épines dendritiques post-synaptiques marquées par fluorescence dans le temps in vivo. Ce protocole utilise une préparation-crâne amincie, ce qui maintient intact le crâne et évite les effets inflammatoires causées par l'exposition des méninges et le cortex. Par conséquent, les images peuvent être acquises immédiatement après surgery est effectuée. La procédure expérimentale peut être effectuée de manière répétitive au cours de différents intervalles de temps allant de quelques heures à plusieurs années. L'application de cette préparation peut également être étendu pour étudier différentes régions et couches corticales, ainsi que d'autres types de cellules, dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Introduction

Le cortex des mammifères participe à de nombreuses fonctions du cerveau, de la perception sensorielle et contrôle des déplacements à l'abstrait traitement de l'information et de la cognition. Diverses fonctions corticales s'appuient sur différents circuits neuronaux, qui sont constitués de différents types de neurones qui communiquent et échangent des informations au niveau des synapses individuelles. La structure et la fonction des synapses sont constamment modifiés en réponse à des expériences et des pathologies. Dans le cerveau mature, la plasticité synaptique prend la forme de deux changements de résistance et ajout / suppression de synapses, jouant u....

Protocole

Approbation doit être obtenue à partir d'institutions d'origine avant le début de la chirurgie et de l'étude d'imagerie. Les expériences décrites dans ce manuscrit ont été réalisées en conformité avec les directives et règlements de l'Université de Californie, Santa Cruz institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

Chirurgie 1.

1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux et stériliser l'espace de travail avec 70% d'alcool bien avant la chirurgie.
2. Anesthésier la souris par voie intrapéritonéale (IP) l'injection d'une solution d'anesthésique KX (200 mg / k....

Résultats

Dans YFP-H ligne ²⁵ souris, la protéine fluorescente jaune exprime dans un sous-ensemble de neurones pyramidaux couche V, qui font saillie de leurs dendrites apicales pour les couches superficielles du cortex. Grâce à la préparation-crâne amincie, les segments dendritiques marquées par fluorescence peuvent être répétitive imagées sous microscope à deux photons sur différents intervalles d'imagerie, allant de quelques heures à plusieurs mois. Ici, nous montrons un exemple de formation d'image à quatre .......

Discussion

Pour obtenir une préparation-de crâne amincie succès, plusieurs étapes de ce protocole sont cruciales. 1) L'épaisseur de la boîte crânienne. L'os crânien a une structure en sandwich, avec deux couches de haute densité osseuse compacte et une couche intermédiaire de faible densité de l'os spongieux. Bien que le micro-foret à haute vitesse est adapté pour enlever les couches externes de l'os compact et l'os spongieux, la lame de microchirurgie est idéal pour l'amincissement de la couche interne de .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kétamine	Bioniche Pharma	67457-034-10	Mélangée à de la xylazine pour l’anesthésie
Xylazine	Lloyd laboratories	139-236	Mélangée à de la kétamine pour l’anesthésie
Saline	Hospira	0409-7983-09	0,9 % NaCl pour l’injection et l’imagerie
Lames de rasoir	Microscopie électronique sciences	72000	Lames de rasoir en acier inoxydable à double tranchant
Tampons d’alcool	Fisher Scientific	06-669-62	Tampons de préparation à l’alcool stériles
Pommade pour les yeux	Henry Schein	102-9470	Pommade ophtalmique à la vaseline Lubrifiant oculaire stérile
Micro-foret à grande vitesse	Outils de sciences fines	18000-17	Le micro-foret à grande vitesse convient pour amincir la couche externe d’os compact et cibler une petite surface
Micro-foret Meules	en acierFine Science Tools	19007-14	1,4 mm de diamètre
	Surgistar	6961	La lame microchirurgicale convient à l’amincissement de la couche interne de l’os compact et de la couche intermédiaire de l’os spongieux
Colle cyanoacrylate	Fisher Scientific	NC9062131	Fixez la plaque de tête sur le crâne
Suture	Havard Appareil	510461	Suture en soie stérile non absorbante, 6-0
Microscope de dissection	Olympus		SZ61
Caméra CCD	Infinity
Microscope à deux photons	Prairie Technologies		Ultima IV
10X objectif	Olympus		NA 0.30,
air 60X objectif	Olympus		NA 1.1, perméable aux IR, immersion dans l’eau
Laser Ti-sapphire	Spectra-Physics		Mai Tai HP

Lame microchirurgicale de monofilament