光镊技术已被用于通过从单个RNA分子的5’和3’端进行拉伸来研究RNA折叠。本文描述了用于光镊实验的RNA分子合成、仪器校准以及操纵单个分子的常用方法。
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本文内容
摘要
摘要
人类基因组的很大一部分能够转录但不进行翻译。在后基因组时代，RNA的调控功能已被证明变得越来越重要。由于RNA的功能往往取决于其形成多种替代结构的能力，因此很难直接从序列预测RNA的三维结构。单分子方法显示出解决RNA结构多态性问题的潜力，能够逐个分子地监测其结构变化。本文介绍了一种利用光镊精确操控单个RNA分子折叠与结构的方法。首先，描述了合成适用于单分子力学研究的分子的方法；接着，讨论了确保光镊正常运行的各种校准步骤；随后，解释了多种实验操作。为展示该技术的应用价值，文中以机械展开RNA发夹结构和单个RNA“吻式”复合物的结果作为例证。在这些实例中，纳米操控技术被用于独立研究各个结构域（包括二级和三级结构）的折叠过程。最后，讨论了该方法的局限性及其未来的应用前景。
引言
光镊技术的发展长期以来一直伴随着其在生物学研究中的应用。当光捕获效应首次被发现时，Arthur Ashkin 观察到污染水中的细菌可以被捕获在激光焦点处1。自那时起，细菌捕获已成为一代又一代生物物理学生无意中进行的有趣实验，同时也成为研究微生物生理学的重要研究工具2,3。光捕获技术利用聚焦的激光束来固定微小物体1。实际上，光阱的作用类似于一个光学弹簧，通过被捕获物体相对于阱中心的位移（ΔX）来测量作用在其上的力（F）。在较小范围内，F = κ x ΔX，其中 κ 为光阱的弹簧常数。光阱能够以皮牛顿（pN）精度对微小物体施加力，并以纳米（nm）精度测量其位置。在过去的二十年中，光镊已成为生物物理学中最常用的单分子技术之一。该技术已被用于研究 DNA4-6、RNA7-9 和蛋白质10,11 的折叠与力学性质。光镊还被用于观察 DNA 复制12、RNA 转录13 和蛋白质合成14,15，以及许多其他生物分子事件16-18。
单分子方法主要用于RNA结构研究，以探索RNA复杂的折叠能景。由于RNA化学组成简单且碱基配对规则明确，一个RNA序列通常可以折叠成多种稳定....
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方案
1. 单分子镊子实验用RNA分子的制备
- 克隆目标序列。将对应于RNA结构的DNA序列克隆至载体中。
- 转录模板的合成与纯化。通过PCR合成转录模板。[place table 1 here] 随后使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并将样品浓缩至>200 ng/µl。由于纯化的DNA将用于转录，因此在洗脱和浓缩步骤中应使用无RNase的水。
- 体外转录。在37 °C下进行过夜体外转录以最大化RNA产量。[place table 2 here] 转录完成后，加入1 µl DNase I，在37 °C孵育15分钟以消化DNA模板。使用二氧化硅离心柱纯化RNA。
- 生物素标记的接头A的合成。首先，使用引物Af和Ar通过PCR扩增生成未修饰的接头A，并将扩增的DNA浓缩至>200 ng/µl。随后，通过引物延伸反应将生物素修饰引入PCR产物中。[place table 3 here] 注意：生物素标记的接头A（biotin-HA）可在不经过纯化的情况下直接用于退火。由于biotin-HA将与RNA退火，因此两个步骤中均必须使用无RNase的水。
- 地高辛标记的接头B的合成。使用引物Bf和地高辛修饰的寡核苷酸Dig-Br通过PCR合成地高辛标记的接头B（dig-HB）（Figure 3）。随后纯化PCR产物，并将样品浓缩至>200 ng/µl。
- RNA与接头的....
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结果
由于空间限制，单个RNA分子的纳米操作仅通过展示RNA发夹结构及具有三级结构的RNA的机械解折叠示例来说明。
操作单个发夹分子
一旦在微珠之间建立了牵引，即可使用用户自定义的程序来操控牵引的延伸长度和施加的力。通常采用四种常见的操控程序。
力-斜坡实验最直观且常见的操纵单个RNA的实验方法是沿手柄螺旋轴方向（如图所示垂直方向）反复拉伸和松弛该分子 图4）。力， F和捕获位置， Y随时间记录。分子的延伸长度， e，可通过以下方式计算 e = Y - F/κ，其中为光镊的弹簧常数。拉伸结果可表示为力-伸长曲线（图8a）。双链手柄的拉伸表现为正斜率上升曲线。手柄的松弛曲线与拉伸曲线重合。简单两态折叠发夹的结构转变显示为具有负斜率的“撕裂”峰，表明发生了一次协同的单步去折叠转变39.......
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讨论
镊取样品制备过程中的修饰与故障排除
克隆载体的选择。尽管此处描述的通用方案（图3）不需要特殊的克隆载体，但优选不含内在T7或T3启动子的载体，以便于转录时可通过PCR在所需位置引入启动子。
接头序列与长度。对接头的序列没有特定要求，但建议保持相近的 GC 与 AT 比例，避免使用同聚物序列和高度重复的序列。在已发表的研究中，两个接头通常保持相似的长度，使目标RNA结构大致位于中间位置。先前的研究表明，接头总长度在 500 至 10,000 个碱基对之间变化时，会对测得的动力学参数产生轻微影响46,47。
退火混合物的质量检测与定量。除了带有接头的预期RNA外，最终产物还包含未退火的DNA接头和RNA，以及其他副产物。纯化这些镊子分子既困难又不经济。取而代之的是，退火后的混合物可直接用于镊子实验，因为只有正确退火的核酸才能被连接到两.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国国家科学基金会（NSF）资助（MCB-1054449）以及奥尔巴尼大学RNA研究所跨学科合作 Pilot Research Program 项目对 PTXL 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微型镊子 | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| 数据采集卡 | National Instruments | USB-6351 | |
| 视频采集卡 | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview 编程软件 | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| 激光雕刻机 | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 试剂盒 | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear 试剂盒 | Life Technologies | AM1908 | |
| 生物素-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA 聚合酶 | New England Labs | M0203 | |
| 链霉亲和素包被微球 | Spherotech | SVP-20-5 | |
| 抗地高辛包被微球 | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| 尺寸标准微球 | Spherotech | PPS-6K | |
| 聚酰亚胺胶带 | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| 2 号盖玻片 | Thermo Fisher | 12-543D |
参考文献
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
- Maier, B. Using la....
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重印与许可
