De geïsoleerde bloed geperfundeerd long bereiding maakt het mogelijk om microvaatje netwerken visualiseren op het longoppervlak. Hier beschrijven we een aanpak om de permeabiliteit van enkele bloedvaten in geïsoleerde longen te kwantificeren met behulp van real-time fluorescentie beeldvorming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De geïsoleerde bloed geperfundeerd long preparaat wordt veel gebruikt visualiseren en definiëren signalering in enige microvaatjes. Door de koppeling van deze voorbereiding met real-time beeldvorming, wordt het mogelijk om de permeabiliteit in de individuele pulmonale bloedvaten te bepalen. Hierin beschrijven we stappen rattenlongen isoleren en perfuseren ze met autoloog bloed. Vervolgens schetsen we stappen om fluoroforen of agenten via een microkatheter bezielen in een kleine long regio. Met behulp van deze procedures beschreven, bepaalden wij permeabiliteit toename rattenlong microvaatjes in reactie op infusies van bacteriële lipopolysaccharide. De gegevens bleek dat lipopolysacharide toegenomen lek in zowel venular en capillaire microvessel segmenten. Dus deze methode is het mogelijk om de permeabiliteit antwoorden vergelijken tussen vasculaire segmenten en daarmee vast elke heterogeniteit in de respons. Terwijl gebruikelijke methoden longpermeabiliteit definiëren nabewerking vereisen longweefsel monsters, degebruik van real-time beeldvorming ondervangt deze eis zoals blijkt uit de huidige werkwijze. Zo is de gïsoleerde voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt verschillende voordelen ten opzichte van traditionele methoden om long microvasculaire permeabiliteit te bepalen, maar is een eenvoudige methode te ontwikkelen en te implementeren.
Inleiding
Verhoogde microvasculaire permeabiliteit in de longen leidt tot ontwikkeling van alveolair oedeem evenals gemanipuleerde gasuitwisseling en is een belangrijk kenmerk van acute longbeschadiging (ALI) 1-3. De ramingen van vasculaire permeabiliteit zijn belangrijk bij het bepalen van de omvang van longbeschadiging en effectiviteit van voorgestelde therapeutische interventies. Gravimetrische analyse zoals bloed vrij long nat-naar-droog-verhouding en microvasculaire filtratie coëfficiënt worden veel gebruikte methoden voor het schatten permeabiliteit 4,5. Andere werkwijzen omvatten het kwantificeren het behoud van radioactieve of fluorescente probes ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten uitgevoerd op dieren waren zoals goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Tennessee Health Science Center.
1. Tubing voor perfunderen Rat Lung Voorbereidingen
- Bereid een buissysteem met Tygon-buis (# 18) voor bloed perfusie zoals getoond in figuur 1. Sluit drukopnemers (P23XL) en plaats de slang op de microscoop podium.
- Stel waterbadtemperatuur tot 37 ° C.
- Sluit de long en uitlaat tijdelijk met Tygon slang.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Geïsoleerd bloed geperfundeerd long preparaat verbonden met de perfusieslang en aanverwante apparatuur wordt getoond in figuur 2. Ter demonstratie, gebruikten we een Sprague Dawley rat, hoewel de hierin beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt met elke soort ratten. Infusions via een linker atrium microkatheter bereikt slechts een klein gebied van de long. De toegediende regio kan worden geïdentificeerd door de infusie veroorzaakte verkleuring (figuur 3). De long preparaat gepositio.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De geïsoleerde-bloed doorbloed long voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt een eenvoudig hulpmiddel voor het bepalen van de permeabiliteit veranderingen in enkele long haarvaten. Wij pasten deze methode doorlaatbaarheid verandert in reactie op infusies van LPS te bepalen. Onze gegevens suggereren duidelijk dat LPS infusie veroorzaakt een toename van de microvasculaire permeabiliteit. Verder, de gegevens blijkt ook dat permeabiliteit veranderingen geïnduceerd door LPS waren vergelijkbaar in beide ve.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De studies werden ondersteund door NIH HL75503 aan KP.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
| Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Hoeveelheid nodig 3 |
| Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21 G |
| Peristaltische pomp | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 buis | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm nodig |
| PE-10 buis | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm nodig |
| Spuitpomp | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O-ring | Op maat gemaakt met een gat van 20 mm diameter en een handvat om de O-ring op de houder te bevestigen | ||
| Rechtopstaande fluorescentiemicroscoop | Olympus America | BX61WI | |
| Beeldverwervingssoftware | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0,5 mg/ml (Een dextran van een andere moleculaire grootte kan worden geselecteerd, als proefexperimenten de geschiktheid aangeven op basis van de berekende permeabiliteitsindexwaarden) | |
| Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |
Referenties
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
