Эхокардиография наведением чрескожная интрамиокардиальные впрыска представляет собой эффективное, надежное и наведения модальность на поставку средств Перенос генов или клеток в мышиной сердце. После действия, описанные в данном протоколе, оператор может быстро стать компетентным в этой разносторонней, минимально инвазивной техники.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ультразвуковая руководствуясь Трансторакальная интрамиокардиальной впрыска у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мышиные модели сердечно-сосудистых заболеваний важны для исследования патофизиологических механизмов и изучения потенциальных регенеративные методы лечения. Опыты с инфарктом инъекции в настоящее время выполняется путем прямого хирургического доступа через торакотомии. В то время как удобно, когда выполняется во время другой экспериментальной манипуляции, такие как лигирования коронарной артерии, потребность в инвазивной процедурой интрамиокардиальной доставки ограничивает потенциальные экспериментальные образцы. С постоянно улучшая разрешение ультразвуковое и передовые неинвазивные методов визуализации, то теперь это возможно, чтобы регулярно выполнять под ультразвуковым контролем, чрескожное интрамиокардиальной инъекции. Эта форма эффективно и надежно обеспечивает агентов к целевой области миокарда. Преимущества этого метода включают избегание хирургической заболеваемости, средство, чтобы целевых регионах миокарда выборочно под ультразвуковым контролем, и возможность поставлять вводимого в myocardiuм при многократных, заданные интервалы времени. С практикуется техники, осложнения от интрамиокардиальной инъекции редки, и мышей быстро вернуться к нормальной деятельности на восстановление от наркоза. После действия, описанные в данном протоколе, оператор с основной опыт эхокардиографии может быстро стать компетентным в этой разносторонней, минимально инвазивной техники.
Введение
Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной смерти среди мужчин и женщин в Соединенных Штатах, что составляет 600 000 смертей в год 1. Мышиные модели сердечно-сосудистых заболеваний являются критически важными для исследования патофизиологических механизмов и для того, чтобы исследовать потенциальные методы лечения. Инфаркт доставка векторов генной терапии, стволовые клетки, модифицированные РНК и других разрешительных документов терапевтические агенты расследование их терапевтический потенциал для болезни сердца 2-7. В настоящее время, есть ограниченные варианты для инфаркта доставки терапевтических агентов в мышиных моделях 6. Интрамиокардиальной инъекции в непосредственной визуализации обычно используется, но требует стернотомию или торакотомии, и ограничена открытой области сердца. В то время как удобно, когда выполняется во время другой экспериментальной манипуляции, такие как LAD лигирования, потребность в инвазивной процедурой интрамиокардиальной доставки ограничивает потенциальные экспериментальные образцы и вводитопо лни тельная эффекты от процедуры (например, фиброз благодаря торакотомии). Чрескожная перикарда доставка вирусных векторов сообщалось, но сайт и распределение терапевтического агента не является однородным и трудно контролировать 8. Чрескожных коронарных Результаты инъекций в более однородным распределением закачиваемой материала, но эффективного и воспроизводимого коронарной доставки является сложной задачей в мышиных моделях.
Здесь мы описываем замкнутую груди интрамиокардиальной технику инъекции, что позволяет минимально инвазивной, оператор контролируется адресности терапевтических агентов под ультразвуковым контролем. Методика проста в освоении, устраняет необходимость в торакотомии или стернотомии и сопровождающими их экспериментальных осложнений, и обеспечивает большую гибкость в отношении сроков и сайтах интрамиокардиальной инъекции. Таким образом, эхокардиография-помощь интрамиокардиальные впрыска представляет собой технически простой и очень эффективный метод манипулированиямиокард в мышиных экспериментальных моделях.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все описанные этапы проводили под протоколами, утвержденными уходу и использованию комитета Институциональная животных больницы Бостонской детской путем.
1 Подготовка
- Выполните базовую сердечной анатомическую и функциональную оценку по эхокардиографии до начала протокола впрыска, как оптимальное положение фиксируется преобразователь для интрамиокардиальной инъекции не может дать оптимальные стандартные представления для разграничения анатомии и оценку функции.
- Установка впрыска показано на фиг.1А-1С. Поместите пустой шприц с оболочкой иглы, конические ориентированных вверх, в шприце зажима (рисунок 1С) и закрепите ультразвукового преобразователя зонда в скан-зажим (рисунок 1В). Ослабить скан-зажим мяч блокировки сустава (рисунок 1b) и манипулировать ориентацию датчика таким образом, чтобы оно располагалось параллельно оси иглы. Закрепите сканеровположение головы, затянув скан-зажим мяч блокировки сустава.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекций у взрослых мышей, 30 G иглы с 1 в / 2,5 см длины является оптимальным. 1 мл шприц может быть использован для больших объемов, в то время как герметичная шприц можно использовать для более точного контроля небольших объемов (5-10 мкл). - Применить ультразвуковое гель либерально до кончика датчика с помощью шпателя, чтобы покрыть голову вдоль всей его полноте. Тщательно обнажить иглу и использовать игла смонтировать управления продвигать иглу непосредственно под преобразователем и в ультразвуковой гель для визуализации. Внести незначительные корректировки с помощью иглы крепление управление так, что игла визуализируется четко вдоль его длины на ультразвуковом изображении. Если датчик был выровнен параллельно иглы в шаге 1.4, то игла должна оставаться в плоскости изображения, как это расширенный и изъяты с контрольной инъекции ручкой (Рисунок 1C).
- В последующих шагах, не беспокоить необходимостьле / преобразователь горизонтального выравнивания путем перемещения в горизонтальном оси. Скорее, ориентироваться на конкретные области сердца для инъекций путем изменения по вертикали (по оси) положение иглы монтирования и, перемещая платформу животных.
- Перемещайте датчик кверху от животного платформы с помощью сканирования контроль высоты (рисунок 1b), чтобы разрешить последующую размещение анестезированной мыши на платформу животных. Это не нарушить выравнивание х-оси преобразователя к продольной оси иглы.
- Удалите шприц, который был использован для выравнивания из шприца зажимом и отбросить тщательно. Загрузите новую иглу и шприц с инжекционной до конечного объема целевой, что позволяет мертвого пространства в наконечника шприца. Будьте осторожны, чтобы удалить пузырьки воздуха. Поместите шприц в шприц зажима без корректировки его выравнивание по оси X.. Полностью убрать шприц с помощью регулятора впрыска.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для начальных учебных целях, использование синего ЭванаКраситель (1%), краситель трипанового синего (0,4%) или суспензию из флуоресцентных микросфер, как инжекционной может помочь оператору при подтверждении компетентности и успеха целевой инъекции.
2 инъекций
- Включите интегрированы теплее нагревательного платформы и установить его на 37 ° C. Поместите платформы животного на 180 ° от обычного ориентации изображения, с зажимом анестезия шланга и голове животного ближайшего к оператору. Это позволяет сердца (в левой части грудной клетки), чтобы быть на той же стороне, чтобы зажим шприца и иглы. Примечание: Дополнительные незначительные по часовой стрелке вращения корректировки платформы животных может быть необходимо ориентировать сердце правильно для парастернального короткой оси плоскости формирования изображения, которое будет использоваться для инъекций (фиг.2А).
- Подготовьте мышей для эхокардиографии, как сообщалось ранее 9. Обезболить мышь в индукционной камере с 2% изофлуран. Удалить волосы на груди с крем для волос удаление апD применяются смазочных гель для обоих глаз, чтобы предотвратить высыхание склеры.
- Поднимите датчик на сканирования контроль высоты головы (рисунок 1b). Поместите наркозом на спине мыши поверх нагретой животных платформе с мордой в носовой обтекатель доставки 1-3% изофлуран (2А-2В). Аккуратно вставьте ректальный зонд и заклеивайте четыре лапы к ЭКГ-электродов, применяя гель для электродов для электрического контакта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий уровень анестезии должно быть обеспечено за гуманное отношение животного. Там не должно быть никаких изменений в частоте сердечных сокращений и нет ответа на размещение иглы через стенку грудной клетки. Интегрированные гомеостатические терморегуляторов животного какой платформы должны быть использованы для поддержания нормотермию (37 ± 0,5 ° С), как гипотермия приведет к относительной брадикардии, желудочковой дилатации, и возможного дискомфорта. - Как только мышь находится в безопасности на платформе животных, снизить преобразователь на depilaТед грудь с помощью сканирования контроль высоты головы (рисунок 1b). Оптимальная настройка УЗИ для инъекций для сердца быть визуализированы в парастернальной короткой оси ориентации, в соответствии со стандартом эхокардиографического техники. Вращения платформы животного 20-30 ° по часовой стрелке, чтобы получить оптимальную акустическую окно для инъекций в короткой оси изображения плоскости (2А-2Б). Примечание: В качестве альтернативы, инъекции могут быть выполнены из парастернальной длинной оси ориентации по против часовой стрелки поворота платформы животных (фиг.2С).
- Используйте элементы управления регулировки платформа животных регулировать поле зрения, и ориентироваться любую желаемую место инъекции в миокарде левого желудочка. Камера отъезжает, и вперед от вершины к основанию сердца целевой нужное место инъекции в миокарда левого желудочка (3А-3С). Примечание: midpapillary парастернальная вид короткой оси (3А) предлагает reproduciblе ориентиры, которые позволяют последующую визуализацию в месте инъекции. Примечание: В качестве альтернативы, парастернальная пор вид ось может быть использован для целевой предопределенный место инъекции (Рисунок 3D).
- Начиная с шприцем в полностью сложенном шприца зажим, медленно продвигаться шприц к груди животного, повернув регулятор впрыска по часовой стрелке (рисунок 4А). Для обеспечения свободного ультразвуковое визуализацию как сердце и кончика иглы по мере приближения к груди, использовать много ультразвукового геля на левой стороне груди и оптимизировать акустическую окно, установив широкое поле зрения на контроль эхокардиографии. Установите Координатор / зону на целевые места для инъекций. Незначительные корректировки иглы монтировать элементы управления могут оптимизировать изображение иглы вдоль его длины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые ультразвуковые машины имеют функцию иглы руководство программного обеспечения для цифровой продлить линию вдоль длинной оси иглы до целевой миокарда(Фиг.4В). Такое программное средство может быть полезным, но не является необходимым. - С животное соответствующим образом седативные (1-3% изофлуран смешивают с 0,5-0,8 л / мин на 100% кислорода), Advance иглу через стенку грудной клетки мыши, и в миокард, тщательно наблюдая положение скошенным кончиком иглы на всех раз. Остановка вперед, когда кончик иглы находится в пределах целевого миокарда (фиг.4С). Весь скошенный кончик должен быть надежно в миокарде, чтобы избежать вводимого вещества утечку в перикарда пространстве.
- Когда кончик находится в нужном месте, доставить вводимого вещества, нажав на поршень шприца. Доставьте вводимого вещества медленно, в течение 5-30 сек (в зависимости от объема доставляется). До 50 мкл вводимого вещества могут быть доставлены без ущерба желудочка функцию. Переходный echobright появление в закачиваемой инфаркта регионе может быть очевидным после успешного введения. Краткий (секунд) период относительной bradycardИ.А. иногда с введением в миокарде отметил и быстро решает.
- После впрыскивания находится под управлением, оперативно вывести иглу на против часовой стрелки вращения ручки управления впрыском. Мышь должна находиться под наркозом в течение нескольких минут эхокардиографического наблюдения для подтверждения сохранившийся функцию желудочков и никаких postprocedural осложнений. Если указано, несколько регионов миокарда может быть последовательно вводят путем перестановки угла иглы подхода путем регулировки платформы животных. После инъекции интрамиокардиальной, Мышь помещают в клетку по себе и давали отойти от анестезии под наблюдением.
- Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение. Не возвращать животное, которое претерпела интрамиокардиальной инъекции в компании других животных, пока полностью не восстановился. Клетка должна быть размещена на терморегулируемой площадку с реADY предоставление воды и мыши диеты. Postprocedural дискомфорт не ожидается и ненадлежащее возобновить нормальное поведение вскоре после вмешательства предполагает потенциальное осложнение (см Обсуждение).
- Осторожно удалите иглу сразу после завершения интрамиокардиальной инъекции, чтобы минимизировать риск травмы острых оператора или прохожих. Повторное использование иглы может привести к притупление кончика делает его более сложным для прокалывания миокарда и приводит к более высокому риску осложнений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мышиный интрамиокардиальной впрыска с синим красителем или флуоресцентных микросфер
Инъекция синего красителя Эвана полезно для учебных целей. Вскоре после инъекции, усыпить мыши и удалить сердце визуализировать расположение введенного синего красителя. Рисунок 5 показывает пример успешного инъекций, с синим красителем проникает миокарда в середине папиллярные уровне мышечной (5А, область заключены пунктирной линией). Эванс синий краситель будет промыть ткани в...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Biologics может быть доставлен в миокарде путем прямой инъекции, интрамиокардиальной intrapericardial инъекции или косвенного управления через кровоток. Недавние испытания клеточной терапии на основе в моделях инфаркта миокарда описали открытый подход торакотомии с доставкой вводимого вещества 12-14. Важным фактором в успехе инфаркта терапевтического вмешательства зависит от выбора маршрут перевозки. Самая высокая локальная доза биологических достигается интрамиокардиальной доставки 15,16. Интрамио...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
TWP был профинансирован Ирландским кардиологическим обществом Брайана Макговерна Traveling Fellowship. WTP был профинансирован R01 HL095712 и премией AHA Established Investigator Award.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ультразвуковая система визуализации Vevo 2100 | Visualsonics | ||
| Vevo Integrated Rail System III | Датчик Visualsonics | ||
| Microscan MS400 | Датчик Visualsonics | ||
| Microscan MS550D | Иглы Visualsonics | ||
| PrecisionGlide | BD | 305128 | 30 G x 1 дюйм/2,5 см |
| 1 куб. см шприц с скользящим наконечником | Exel International | 26048 | или аналог |
| Газоплотный 50 μ l стеклянные шприцы | Hamilton | 1705 | |
| Трипан синий морилка (0.4%) | Gibco | 15250 | или эквивалент |
| изофлурана | Baxter | AHN3640 | или эквивалент |
| Aquasonic 100 | Parker Laboratories | (01-08) | или эквивалент |
| микросфер из полистирола (красный флуоресцентный) | Life Technologies | F-8842 | или эквивалент |
Ссылки
- Kochanek, K. D., et al. Deaths: final data for 2009. Natl Vital Stat Rep. 60 (3), 1-117 Forthcoming.
- Strauer, B. E., Steinhoff, G. 10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stem cell therapy of the heart: from the methodological origin to clinical practice. J Am Coll Cardiol. 58, 1095-1104 (2011).
- Cheng, K., et al. Intramyocardial autologous cell engraftment in patients with ischaemic heart failure: a meta-analysis of randomised controlled trials. Heart Lung Circ. 22 (11), 887-894 (2013).
- Fischer-Rasokat, U., et al. A pilot trial to assess potential effects of selective intracoronary bone marrow-derived progenitor cell infusion in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy: final 1-year results of the transplantation of progenitor cells and functional regeneration enhancement pilot trial in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy. Circ Heart Fail. 2, 417-423 (2009).
- Seth, S., et al. Percutaneous intracoronary cellular cardiomyoplasty for nonischemic cardiomyopathy: clinical and histopathological results: the first-in-man ABCD (autologous bone marrow cells in dilated cardiomyopathy) trial. J Am Coll Cardiol. 48, 2350-2351 (2006).
- Ladage, D., et al. Percutaneous methods of vector delivery in preclinical models. Gene Ther. 19, 637-641 (2012).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nat Biotechnol. 31, 898-907 (2013).
- Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386 (3), 227-238 (2013).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H. Transthoracic echocardiography in mice. J Vis Exp. (39), e1738(2010).
- Wang, G., et al. Characterization of cis-regulating elements and trans-activating factors of the rat cardiac troponin T gene. J Biol Chem. 269, 30595-30603 (1994).
- Shimshek, D. R., et al. Codon-improved Cre recombinase (iCre) expression in the mouse. Genesis. 32, 19-26 (2002).
- Lichtenauer, M., et al. Intravenous and intramyocardial injection of apoptotic white blood cell suspensions prevents ventricular remodelling by increasing elastin expression in cardiac scar tissue after myocardial infarction. Basic Res Cardiol. 106 (4), 645-655 (2011).
- Herrmann, J. L., et al. Postinfarct intramyocardial injection of mesenchymal stem cells pretreated with TGF-alpha improves acute myocardial function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), 371-378 (2010).
- Zhou, Y., et al. Direct injection of autologous mesenchymal stromal cells improves myocardial function. Biochem Biophys Res Commun. 390 (3), 902-907 (2009).
- Campbell, N. G., Suzuki, K. Cell delivery routes for stem cell therapy to the heart: current and future approaches. J Cardiovasc Transl Res. 5 (5), 713-726 (2012).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, Suppl 9. 150-156 (2005).
- Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research). JACC Cardiovasc Interv. 3 (3), 265-275 (2010).
- Dib, N., et al. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
