구조적, 기능적, 생화학적 특성을 결정하기 위한 골격근 조직의 분석은 적절한 준비에 의해 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 광범위한 표현형 연구를 위해 골격근 조직을 준비하는 적절한 방법을 설명합니다.
이 논문에서
요약
초록
골격 근육 때문에, 기능 세포, 분자, 병리학 적 평가에서 최적의 결과를 얻기 위해 조직 수집을위한 특정 프로토콜을 필요로 그 구조와 기능의 고유 한 조직이다. 선천성 근육 질환에 대한 골격 근육을 평가할 때 인해 선천성 근육 질환 및 이러한 기능의 인식을 방해하는 고정의 가능성을 볼 몇 가지 병리학 적 이상 소견의 미묘함에, 냉동 근육의 병적 인 평가는 고정 근육에 바람직하다. 다른 조직을 동결 할 때 일반적으로 사용하지 않는 조직 학적 검사에 대한 골격 근육을 동결 할 때 또한 근육에 심한 동결 아티팩트를 생성 할 수있는 잠재력이 특정주의가 필요합니다. 이 필사본 최적 골격근 형태를 보존하기 위해 액체 질소로 냉각 한 이소 펜탄 (2 - 메틸 부탄)를 사용하여 골격근의 급속 냉동을위한 프로토콜을 설명한다. 이 절차는 또한 F에 효과적이다유전자 또는 단백질 발현 연구를위한 조직을 reezing. 또한, 우리는 수집하는 데 필요한 최소의 노력에 초점을도 (1) 단 하나 섬유의 기능 연구 (2) 근원 세포의 세포 배양을위한 조직의 단기 부상자 명단에 대한 선호하는 방법을 설명하는 광범위한 절차로 우리의 동결 프로토콜을 통합 한 조직과 이러한 연구를 완료하기 위해 전문 연구 또는 참고 실험실에 수송한다. 전반적으로,이 원고는 신선한 조직이 효과적으로 표현형 연구 다양한 분배 될 수있는 방법의 개요를 제공함으로써 선천성 근육 질환과 관련된 병리학 적 연구에 대한 표준 작업 절차 (SOP에)를 제공한다.
서론
골격근은 구조와 기능으로 인해 독특한 조직이므로 병리학을 평가할 때 여러 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 포르말린 고정 및 파라핀 포매 후 대부분의 조직을 평가하는 것으로 충분하고 종종 최적이지만, 이 과정은 선천성 근육 질환(근섬유 크기 및 모양 포함)에서 중요한 표현형의 평가를 손상시키는 세포 수축 인공물의 생성으로 이어집니다. 또한, 다양한 선천성 근병증, 미토콘드리아 근병증 및 저장 질환을 진단하는 데 필요한 특정 병리학적 이상을 검출하는 데 필수적인 많은 조직화학적 염색(환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH), 시토크롬 산화효소(COX), 숙시네이트 데히로게나제(SDH), 아데노신 트리포스파타제(ATPase) 및 오일 레드 O 염색을 수행할 때 동결된 근육이 필요합니다. 근육의 형태와 기능을 특성화하는 데 사용되는 많은 항체와 분자 도구는 결과적으로 동결 조직에만 개발되고 최적화되었으며, 이는 골격근 생물학 연구에서 고정 조직 제제의 유용성을 더욱 제한합니다. 그 결과, 적절한 동결이 제기될 수 있는 기술적 문제에도 불구하고 선천성 근육 질환 분야의 대부분의 임상 및 연구 적응증에 대해 골격근 표본을 동결하는 것이 표준 관행이 되었습니다.
골격근의 동결은 부적절한 동결 프로토콜을 따를 경우 근섬유(myofibers) 내에서 얼음 결정이 형성될 가능성이 높기 때문에 기술적으로 어려울 수 있습니다1. 대부분의 경우 조직의 수분 함량이 너무 높거나 동결 과정이 너무 느릴 때 동결 아티팩트가 발생합니다. 조직의 수분 함량은 식염수로 근육을 운반하는 것과 같은 액체에 담그면 우연히 증가할 수 있습니다. 또는 조직이 OCT에 완전히 잠긴 경우 동결이 손상될 수 있습니다. 이 두 가지 절차 모두 근육 조직에 치명적인 동결 인공물을 유발할 수 있습니다. 또한 냉동 공정의 여러 가지 작은 실수로 인해 적절한 냉동 후 샘플이 천천히 동결되거나 우발적으로 해동될 수 있으며, 이러한 문제는 병리학적 평가를 복잡하게 만들 수 있습니다.
골격근 질환에 대한 새로운 모델과 치료법이 개발됨에 따라 골격근 표현형과 치료 효능을 평가하기 위해 표준 수술 절차(SOP)를 사용하는 것이 점점 더 유용해질 것입니다. 이는 선천성 근육 질환의 병리학적 평가에 특히 중요한데, 이러한 질환 중 많은 부분에서 볼 수 있는 미묘한 표현형에 대한 인식이 부적절한 조직 준비로 인해 손상될 수 있기 때문입니다. 이 보고서는 선천성 근육 질환 모델 연구를 위한 골격근 동결 SOP를 수립하기 위한 선천성 근육 질환 컨소시엄의 노력을 나타냅니다.
여기에 제시된 프로토콜은 다양한 단백질 기반 및 유전 연구에 적합하는 동시에 동결 근육 병리학의 평가를 최적화하기 위해 임상 및 연구 실험실에서 사용되는 전략을 설명합니다. 전자 현미경을 위해 골격근 표본을 준비하기 위한 구체적인 전략도 제시됩니다. 또한, 냉동 조직의 단일 섬유 기능 테스트가 가능하기 때문에2,3 이러한 기술의 전문가들은 최적의 조직 취급 프로토콜에 대한 세부 정보를 제공했습니다. 불행히도, 근아세포 세포주의 분리는 사전 동결된 조직에서 효과적으로 수행될 수 없기 때문에, 외부 실험실에서 근아세포 배양 확립을 위한 근육 조직의 단기 저장 및 수송을 위한 전략이 여기에 제시되어 있습니다. 전반적으로, 여기에 설명된 방법은 주어진 실험실의 현장 능력에 관계없이 다양한 병리학적, 기능적, 분자 및 세포 연구를 위해 근육 조직의 적절한 처리를 위한 지침을 제공합니다.
프로토콜
수확 한 동물의 근육에 적절한 식별자와 근육의 저장에 사용되는 컨테이너를 라벨. 가 추가 될 때 잡화 / 용기 악기 조직의 동결 / 해동을 방지하기 위해 미리 차게.
근육 조직 컬렉션 1. 연구 설계 고려 사항
- 작은 동물 모델에서는 병리학 적 연구에 대한 충분한 근섬유 샘플링을 제공하기 위해 전체 근육의 평가를 필요로하기 때문에 작은 동물의 경우 근육 질환 (쥐) 모델은 연구를 위해 전체 근육을 사용합니다. 큰 동물의 경우 근육 질환 (개) 모델은, 자신의 횡 방향 (단면) 측면에서 최소 0.3 × 0.3 cm 또는 큰 근육 부분을 사용합니다.
NOTE : 코어 생검도 사용할 수 있지만, 샘플링 문제로 인해 기본 특성화 연구 차선책 일 수있다. - 근절과 관련된 연구의 경우, 근절 길이의 미세 측정은 중요한 엔드 포인트를 포함 할 수 있고, requ에있다분노 취급 전문. 이것은 일반적으로 질병에만 해당 사항이있는 네 말린 근육 병증의 몇 가지 원인에서와 근절 쇼 부적절한 길이의 요소입니다. 일부 연구소는 오히려 비 인장 또는 비 뻗어 근육에 이러한 측정을 수행하는 것보다, 그 이외의 계약 또는 신장 상태로 근육을 해결하는 것을 선호합니다.
- 근절의 길이가 측정 할 수없는 경우, (시약 참조) 원하는 EM의 정착에 직접 배치하여 근육을 사전 스트레칭없이 근육 조직을 고정합니다.
- 근절 길이가 측정 될 경우, (설명 참조) 근육을 미리 스트레칭 몇 가지 기술이 사용될 수있다 :
- 그것은 동물에있는 동안의 휴식 긴장의 근육을 유지하는 클램핑 장치를 사용하여, 클램프의 외부 주위 근육을 절제하고 (시약 참조) 원하는 EM의 정착에 직접 배치합니다.
- 스트레치하고 관찰과 비슷한 길이에 (예 : 코르크 조각으로) 표면에 근육을 고정 후.
2. 원하는 연구에 적합한 조각으로 분리 된 골격근을 하위 분할 (그림 1)
- 얼어 붙은 근육 조직 검사의 경우 :
- 샘플링 바이어스를 최소화한다 (단계 1.1 참조)하지만, 표본 <유물을 동결 방지하기 위해 1.5 cm해야 할 가능한 특정 근육의 많은 부분을 포함합니다.
- 때문에 취급에 차이가 섬유 크기 인공적인 차이를 방지하기 위해 유사 같은 연구에서 모든 근육을 처리합니다.
- 전자 현미경 (EM)의 경우 :
- 일본어 근육의 종축에 평행 한 샘플의 길이 방향 축과, 시료로부터 근육 ~ 0.5 × 0.2 × 0.2 cm 스트립을 잘라.
참고 : 정착 적절 그래서 2mm 이하의 시편 두께를 유지, 조직의 두꺼운 조각을 침투하지 않습니다 적절한 결과를 얻기에 매우 중요합니다. 또한,근육의 이러한 작은 조각의 방향이 자주 어렵 기 때문에, 그것은으로 근육의 실제 방향 (즉, 고정 된 시험편의 긴 측면은 근육 / 근섬유의 길이 방향이다)를 모방 한 조직의 조각을 사용하는 것이 좋습니다 EM 처리 중에 처리 및 혼란을 최소화합니다.
- 일본어 근육의 종축에 평행 한 샘플의 길이 방향 축과, 시료로부터 근육 ~ 0.5 × 0.2 × 0.2 cm 스트립을 잘라.
- 세포 배양의 경우 :
- 원하는 세포 수율은 세포 배양 설립에 필요한 근육의 양에 영향을 미칠 수 있습니다. 단일 근육 (또는 근육의 일부) 작은 동물에서 세포 배양을 설정하는 부족의 휴대 번호를 제공, 그래서 수 있습니다 필요한 경우, 여러 개의 근육에서 수영장 조직.
전자 현미경 (EM) 3. 조직의 고정 및 처리
- (시약 참조) 원하는 EM의 정착에 직접 얇은 차원에서 2mm보다 더 큰 근육의 조각을 놓습니다.
- fixati의 2-48 시간 후 (시약 참조) EM의 정착 버퍼에있는 근육을 놓고에. (몇 주 또는 몇 달) 장기간 고정은 EM 연구에 미세 디테일의 손실이 발생할 수 있습니다.
- 처리를 위해 EM의 핵심 시설로 보냅니다.
조직 학적, 생화학 적, 분자 연구 4. 근육 냉동
- 조직이 수건에 약간 부착 될 때까지 철저하게 종이 타월로 표본을 내듯 시편의 과도한 수분을 제거합니다. 과도한 수분은 근육에 상당한 냉동 아티팩트를 생성합니다.
참고 : 조직이 더 베이비 파우더에서 압연하여 건조 할 수있다. 그들은 지나치게 습한 환경에서되지 않는 한이 단계는 일반적으로 근육이 필요하지 않습니다. - 중심 근육 (그림 2C)에 대한 기초를 제공 할 수있을만큼 10월으로, 얕은 cryomold의 바닥이나 코르크 10월 (또는 트라가 칸트 검과 유사한 접착제)를 놓습니다. 냉동 전에 코르크 또는 cryomold 레이블링 표본 추적하는 데 유용 할 수있다.
- Carefully 단면 한 근육 10 월 (도 2c)에 접촉되지 않도록 OCT를 돌출 근육의 대다수와, 원하는 방향으로 주형에 근육을 배치.
- 이 약 3 ~ 4 cm의 깊이에 도달 할 때까지 금속 컵에 이소 펜탄을 추가합니다.
- 열 안전 장갑에 넣고 듀어의 뚜껑을 제거합니다.
- 컵의 외부에 액체 질소의 수준은 컵의 내부에 이소 펜탄의 레벨 이상이되도록, 액체 질소와 접촉 금속 컵을 놓거나 잡아. 이러한 컨테이너를 준비하는 전략은 그림 2에 나타내었다.
- 이 작업하기 번거로울 수 있습니다 버블 거품을 생성 (동결에 대해도 충분히 찬)로, 액체 질소가 금속 컵을 입력 할 수 없습니다.
- 그것은 적절한 온도에 도달 할 때 결정하기 위해 이소 펜탄을 준수하십시오. 적절한 온도 (최적 사이 -140 -149에 ° C에서), 그래서냉동 이소 펜탄의 뚜껑 흰색 자갈 (몇 분 후, 초기 안개 이소 펜탄 위에 사라진 후)를 형성한다 컵의 바닥, 또는 솔루션에 일반적으로 당밀의 일관성을 두껍게합니다. 이전에이 단계에 동결하면 동결 atifacts을 얻을 것입니다.
- 이소 펜탄 완전히 고체 정지하는 경우, 해동 및 후속 사용하기 전에 다시 냉동 온도에 진정.
- 미리 냉장 집게를 사용하여, 약 10 ~ 20 초 동안 이소 펜탄에 표본 및 코르크 / 금형을 낮 춥니 다.
- 미리 냉각 용기에 냉동 표본을 놓습니다.
- -80 ° C의 냉동고로 전송 될 때까지 항상 드라이 아이스에 표본과 용기를 보관하십시오.
냉동 이슈는 이미 냉동 조직에있는 경우 5., 그 절차는 다음과 같은 사용하여 냉동 이슈의 정도를 개선 "해동 및 재 냉동"할 수있다
- 한 번에 냉장고, 한 중 블록을, 드라이 얼음에 보관하십시오. 이 프로토콜의 타이밍은 중요하다. 남은 해동하고 한 번에 하나의 블록을 재 냉동.
- 드라이 아이스에서 RT로 샘플을 이동합니다.
- 샘플이 OCT에서 포함 된 경우, 메스를 사용하여 가능한 한 완전히 주변 OCT를 제거합니다.
- 샘플이 있지만이 건조되는 지점에, 그것은 완전히 해동되는 지점에 실온에서 해동 할 수 있습니다.
- 가볍게 시편 전체가 다음 단계로 진행하기 전에 해동 될 수 있도록 집게로 표본을 자극.
- 단계 4.1-4.10에 규정 된 근육을 고정.
벗겨진 단일 섬유 기능 테스트를위한 근육의 6. 준비
- 근육의 저장 과정은 근육 / 섬유가 실험에 사용되는 경우에 따라 다르다.
- 몇 주 이내에 사용을 위해 -20 ℃에서 (시약 참조) 솔루션을 휴식 50 % glycerol/50 %의 용액에 근육을 배치하고 매장
- 사용 선미에 대한몇 주 어, C. -80 ° (시약 참조) 솔루션을 휴식 최대 75 % glycerol/25 %의 용액에 근육을 배치하고 매장
- 또한, -80 ℃에서 실리카 입자에 근육 건조, 핀 코르크 및 저장을하자 이러한 탈수 근육 동안 사용될 수있다.
외부 연구소에 세포 배양의 선적 신선한 근육의 7. 준비
세포 배양의 설립을위한 프로토콜이 다른 4-7 잘 설명되어있다.
- 멸균 완료 성장 매체와 50 ㎖ 멸균 원뿔 관을 입력합니다.
- 완전 배지에서 조직을 침지, 무균 핀셋을 사용하여 튜브에 근조직 추가.
- 운송 중에 건조를 방지하기 위해 미디어와 튜브의 나머지 부분을 입력합니다.
- 스티로폼 상자에 얼음 팩을 추가하고 몇 가지 얼음 팩 근처 원뿔 튜브를 놓습니다.
- 만 얼음 팩 (그리고 드라이 아이스)이 사용되어야 함을 유의하시기 바랍니다액체 및 조직의 동결로 인한 손상을 방지.
- 선박 패키지 O / N, 그러나 조직은 이러한 조건에서 이일을 지속 할 수있다.
결과
부적절한 동결 본 유물의 예를 제공하기 위해, 몇 번의 마우스 대퇴사 두근 근육은 일반적으로 발생하는 오류를 복제하는 다른 기술 (그림 3)를 사용하여 고정 하였다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 적절히 언 골격근은 주변 조직 (보통 다른 근육 섬유, 그러나 때때로 근섬유 사이 근섬유 공간 질병이나 부상 프로세스의 다양한 섬유증 또는 염증 세포로 채워진다)에 근섬유의 타이트 동격을 나타내고 명확하게 볼 수 세포질 구획. 깨끗이 이것으로 퇴행성 변화, 회생 변경, 또는 다른 pathognomonic 발견 (중심 핵, 세포 내 개재물)의 존재를 파악하는 것이 중요하다 같이 병리 분석을 위해, 세포 내 공간을 볼 수있는 능력은, 종종 근섬유 격실보다 중요 공간. 따라서, 세포 내 구획에서 얼음 결정의 존재는 오전을 나타냅니다근육의 병적 인 평가에 ajor 문제.
근육 조직의 적절한 동결은 모두 충분히 차가운 온도와 얼음 결정의 형성을 방지하기 위해 동결 충분한 속도가 필요합니다. 두 요소를 차지하더라도, 상당한 동결 이슈는 여전히 근육 조직 내에 있기 때문에 과도한 습기가 발생할 수 있습니다. 이 문제는 일반적으로 이전에 식염수에 담가 충분히 건조 또는 근육 10 월 (그림 3B, 3E)을 절편의 사이트에서 미디어를 장착과 직접 접촉 한 경우되었던 근육 조직에서 발생합니다. 10월 일부 접촉이 설치 과정의 결과로 일반적으로 피할 수 있지만, 모든 노력은 조직 학적으로 평가하고 OCT를 설치하는 데 사용됩니다 영역 사이의 접촉을 피하도록해야한다. 대조적으로, -80 ° C 냉동고 (도 3c) 및 액체 질소 (도 3D)을 사용하여 언 샘플은 예를 선택해동결 차선 온도 나 속도에 의해 생산되는 냉동 유물들. -80 ° C의 냉동고에 조직을 배치하여 발생하는 느린 냉동 과정은 이슈를 동결의 극단적 인 예를 제공합니다. 액체 질소를 사용하는 경우, 주요 문제는 액체 질소와 조직 사이의 접촉이 조직 - 액체 계면에 형성하는 질소 가스의 칼집을 발생하고,이 기체 인터페이스는 한 냉동 급속한 근육을 생성하기에 충분히 차가운 없다는 것이다. 이는 표본의 표면 근처 상당한 냉동 아티팩트를 생성 할 수 있지만, 검체의 내부 영역은 적절한 비율로 플래시 동결 가능성이 통째로 이슈 동결 절약 될 수있다. 액체 질소에있는 근육 조직의 간단한 침수 이소 펜탄 냉동 과정과 같은 유용한 근처 아무데도 동안, 이소 펜탄 등 기관에서 임상 해부 표본으로 (사용할 수있는 상황에서 큰 근육 표본의 동결을 위해 유용 할 수 있습니다아웃 임상 근육 병리 연구소). (여러 차원에서> 2cm) 조직의 많은 부분을 사용하는 경우이 전략을 사용하고 결과는 일반적으로 더 있습니다.
냉동 아티팩트의 회피가 최적의 조직 학적 결과를 제공하고 있지만, 기술은 실질적으로 부적절 냉동 조직의 평가가 가능 아티팩트 냉동 반전이 또한 개발되었다 (본원에 기술 됨) 하였다. 잘못 (그림 3E) 동결 된 조직은 해동 섬유 내의 물을 재분배 할 수 있도록 엄격하게 통제 조건 (그림 3 층)에서 다시 냉동 및 얻을 수있다 형태 보존 정도가 우수 할 수있다 할 수있다. 우리의 경험에서,이 프로세스는 주목할 정도로 조직의 세포 형태를 유지하지만, 종종 근섬유 공간 내의 섬유의 인공적인 분리를 생성한다. 많은 병적 인 엔드 포인트는 세포 내 공간과 그의에서 발견되는근섬유 공간이 가장 좋은 (섬유증을 강조하거나 다른 세포 유형을 식별하는 하나) 특수 얼룩을 사용하여 볼 수 있습니다, 이러한 인공적인 변화는 진정으로 근육의 병적 인 평가를 저해 할 가능성이 있습니다.
골격근의 구조적, 기능적, 및 셀룰러 연구 조직의 그림 1. 아지. 원하는 연구의 종류에 따라, 수집 된 골격 근육 조직은 최적의 결과를 위해 다양한 방법으로 처리 될 수있다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 전문가의 핵심 시설에서 얻을 수있는 결과를 최적화하기 위해 오프 사이트 연구에 대한 골격 근육 표본을 triaging 또는 처리하는 방법을 설명합니다.
그림 2. 근육 냉동에 사용되는 장치의 예. 프로토콜에서 설명한 바와 같이, 최적의 근육 동결은 냉동 온도에 이소 펜탄에있는 근육 조직의 몰입을 필요로한다. 빙냉 이소 펜탄을 얻는 안전하고 효율적인 수단은 액체 질소를 함유하는 주변 듀어에서 냉각되는 이소 펜탄을위한 금속 용기의 사용을 포함한다. 이 양손을 자유롭게하도록 종종 편리로서, 두 액체의 혼합물을 방지하면서, 액체 질소에 이소 펜탄 용기를 보유하는 등 (A)을 스탠드 링으로서 보조기를 사용하는 것이 가능하다. 또한, 컨테이너는 수동으로 액체 질소 (B)에서 개최 될 수있다. 어느 경우 든, 조직 펜탄가 가시적 용기 (보통 불투명 백색 자갈)의 하단에 동결 된 후 완전한 냉동 있도록 10-20 초 동안 침지한다까지 펜탄에 배치되어서는 안된다. Isope동결 온도 ntane 최소한 "포그"를, (상당한 안개가 존재하는 경우, 즉, 온도가 불충분) 생성한다. 조직이 동결되면, 냉동 후 해동 사고를 방지하기 위해 (냉각기 또는 냉장고에 직접 다음과) 사전 냉각 용기에 직접 넣습니다. (C) 적절하게 장착 냉동 근육 냉동 OCT의베이스로부터 돌출 된 근육 조직의 대부분을 수행한다.
10월 설치 매체와 접촉, (C) 근육 냉동 상태 (A) 적절 이소 펜탄 냉동 근육의 그림 3. 이슈를 동결하고 효과적인 해동 / 재 냉동의 예. 대표 이미지는 (B) 근육은 이소 펜탄에 적절하게 고정하지만, -80 ° C 냉동고, 및 (D에 ) 근육이 이슈를 동결 다양한 각도 표시, 모두 액체 질소에 냉동. (B)에 나타낸 바와 같이, OCT의 높은 액체 함량은 그것과 접촉하는 근육에 상당한 냉동 아티팩트를 장착하기위한 필수의 OCT 이렇게 단지 최소량 사용해야 생산 및 조직 학적 평가를 위해 근육 "서 있어야 표면에서 "중. (C) -80 ° C 냉동고 또는 (D) 액체 질소 (차가운 얼음 이소 펜탄으로 동결의 속도를 기준으로)를 사용하여 냉동 프로세스의 속도 저하가 중요한 냉동 유물의 생산으로 이어질 수 있습니다. (때문에 10월과 과도한 접촉에) 처음 suboptimally 냉동 (E) 한 후 (F) 해동 여기에 설명 된 기술을 사용하여 다시 냉동 동일한 표본에서 패널 E와 F 쇼 근육. 하나는 다시 냉동 샘플에서 섬유 사이에 인공적인 분리를 관찰 할 수 있지만, 개선 된 In은 근육 섬유의 세포 형태를 쉽게 알 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
골격근은 구조적으로 그리고 기능적으로 독특한 조직이며, 전문화 준비 절차는 구조적 및 기능적 파라미터의 최적의 평가를 허용 할 필요가있다. 다양한 조직은 일반적으로 임상과 연구 상황에서 병리학 연구에 고정되는 반면, 비 근육 조직에 대한 동결 프로토콜은 일반적으로 동결하기 전에 OCT에서 조직의 몰입을 포함한다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 이러한 프로토콜은 골격근의 병리학 적 평가를 위해 적합하지 아직이 일반적으로 발생하는 오류라고 기재 프로토콜 충분히 유사하다. 이 논문의 목적은이 같은 문제를 방지하기 위해 근육의 적절한 처리를위한 간단한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 조언도 경우에 외부의 핵심 연구소로 고품질 데이터의 수집을 용이하게하기위한 노력의 일환으로 오프 사이트 생리 학적 및 세포 연구에 대한 근육의 적절한 처리에 컴파일 된 갔지다시 현장 연구는 바람직하거나 할 수 없습니다.
이 프로토콜에 명시된 바와 같이, 병리학 적 연구에 대한 근육의 적절한 처리에 절대적으로 필수적인 요소는 조직의 수분 함량을 최소화하는 근육이 고정되는 온도를 감소하고, 동결이 달성되는 속도를 증가 있습니다. 조직 또는 (액체 질소로 발생 불충분 한 온도 또는 냉동 에이전트와 조직 사이의 직접 접촉의 부족에 의해 생성) 냉동 과정의 과도한 속도 저하 내의 과도한 수분은 병리학 적 분석에 악영향을 줄 수 유물을 동결로 이어질 것입니다. OCT를 조직의 수분의 추가 소스를 제공, 많은 실험실 내장 기판으로 검 트라가 칸트와 같은 다른 접착제를 사용합니다. 심지어 동결이 적절하게 수행되는 경우에, 치료는 RT 용기 또는 악기와 접촉을 통해 이후에 실수로 해동 표본을 방지하기 위해주의해야한다.따라서, 성공적인 냉동 공정은 사용되는 모든기구와 용기의 사전 냉각을 포함 계획도를 필요로한다. 냉동 아티팩트가 발생하는 경우, 대부분의 병리학 적 평가에 충분한 조직의 복구를 위해 여기에 설명 된 방법이있다. 그러나,이 동결 / 해동 사이클은 완벽 조직학을 제공하고 (다시 동결 조직에 필요한 시간에 부가하여) 조직의 다른 분자 또는 효소 연구를 저해 할 가능성이 있으므로 적절한 초기 냉동 방법을 사용하는 것이 크게 바람직하지 . 동결 이슈가 미리 고정 된 조직에서 발견 될 경우에, 그러나, 본 명세서에 기재된 기술은 매우 유용 할 수있다.
EM 전에 조직 컬렉션에 대한 계획이 필요 특정 기술 과제를 제공 할 수 있습니다에 대한 조직의 고정 및 처리. EM위한 표본을 수집 가장 일반적인 오류 glutaraldehyd 너무 두꺼운 조직 단편의 사용을 포함전자 침투. 글루 타르 알데히드는 주어진 표면주의에서 근육 조직으로 약 0.1 cm 침투으로 EM 샘플들의 한 사이즈가 더 두꺼운보다 0.2 cm이다 않도록주의해야한다. EM 직접 수축 평가 장치의 훌륭한 수단으로 또한 일부 연구자들은 전략을 개발 한 근육 전에 고정에 미리 긴장 또는 사전 스트레칭 생리학 관련 긴장으로 수축 요소를 측정 할 수 있도록한다. 이 사전 장력에 대한 표준 프로토콜은 없지만, 두 가지 전략은 간단하게이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 그것은 그들이 매우 특정한 방식으로 수행되고, 그것은 비표준 통해 근절 길이 인공적 변경을 방지하기 위해 슬랙 상태에서 근육을 고정하는 것이 바람직 할 수있다 않는 근육은 예측할 수없는 결과를 초래할 수 사전 인장하려고 주목해야한다 사전 장력 절차 8,9. 이러한 특정 측정은 대부분 B를 포함하여 (필요하지 않은되는 근육임상 목적을 위해 수행 iopsies)가 근육을 긴장 미리보기하기위한 노력은 일반적으로 이루어지지되고, 근육 형태에 주요 효과는 근육 sarcomeres의 불균일 한 간격이다.
이 논문은 선천성 근육 질환 필드 테스트의 성능 SOP를 제공하는 시리즈 제를 의미하고, 일상적 셀룰러 분자 기능성 생리 수행 선천성 근육 질환 분야에서 20 전문가의 노력을 나타내고, 병리학 적 연구. 게시 된 SOP의 범위는 다음 해에 사용할 수 있으며 각에 필요한 프로토콜 및 해당 출판물의 형식은이 SOP 노력의 목표는 제공하는 것입니다 워싱턴 DC 2013 년 4 월에 개최되는 선천성 근육 질환 컨소시엄 워크샵에서 논의 된 1) m로 우리의 분야에서 사용되는 방법과 끝점을 표준화하기 위해 선천성 근육 질환 분야에서 필요한 시험 및 검체 분석 용 로드맵가능하고 UCH 2) 우리의 분야에서 새로운 연구에 대한 표준 관행에 명령을 제공합니다. 우리는 이러한 자원은 우리의에서 연구 된 분야에 새로운 수사관의 진입을 용이하게하고, 따라서 수행 할 수있는 연구의 범위를 향상시킬 수 있다고 생각합니다. 또한, 관행의 표준화 연구를 통해 데이터를 비교하고 전임상 및 임상 시험을 계획하고 수행 할 때 엔드 포인트를 식별하는 데 매우 도움이 될 것입니다.
이 문서의 주요 초점은 다양한 연구에 적합한 동결 및 조직의 준비와 관련이 있지만, 우리의 협력 그룹은 또한 근육 표본의 병리학 적 분석을위한 유용한 끝점을 논의했다. 현재,이 병적 인 분석을 수행 할 때 취할 수있는 방법에 대한 공식적인 합의가없고, 다른 연구의 다양한 각각의 질병에 대한 사전 출판물에 새로운 연구 결과를 관련시키는 수행됩니다. 따라서, 우리는 그것이 유용 할 것이라고 생각근육 병리 특성에 병적 인 엔드 포인트의 계획에 대한 몇 가지 일반적인 지침을 제안한다. 이전 연구에서 병리 정량화에 상당한 생각) (1)에 섬유 크기 측정 방법을 넣어되어야 2) 섬유 타입 별 이상 또는 치료 효과의 가능성은, 3)의 이상 또는 효과의 가능성이 제한되는 각각의 근육에, 4) 연구에서 질병에 대한 특징적인 병리 소견을 정량화하기위한 전략. 섬유 크기는 대부분의 연구에 필요한 엔드 포인트이며, 불행히도 정량 방법에있는 광대 한 차이가 있습니다. 많은 연구는 독자적인 이미징 소프트웨어가 제공하는 자동화 된 정량 방법을 사용하여 이러한 결과를보고 있지만, 이러한 프로그램의 대부분은 이러한 자동화 된 측정이 부정확 한 렌더링 할 수 있습니다 (예 : 섬유는 원이나 타원 것을 가정 등) 바로 가기를 취할. 이들 자동화 된 프로그램이 자신의 측정 B를 만드는 방법을 이해하는 것이 필요하다efore 측정에 대한 자신감을 가지고, 우리는 종이 방법에 이러한 내용을 포함하는 조사를 바랍니다. 또한 섬유 크기를 나타내는 데 사용되는 구체적인 측정은 매우 변수이며, 일부 측정은 다른 10,11에 바람직하다. 섬유 크기의 일반적으로 사용되는 측정은 생리 학적 연구를 수행하는 연구자는 자신의 악기를 사용하여 수득 CSA 측정에 그들의 결과를 표준화하기 때문에, 특히, 섬유의 단면적 (CSA)이다. CSA 측정이 정확하게 완벽한 가로 섹션에서 섬유의 크기를 반영 할 수있는 동안 불행하게도, 그들은 (종 방향 또는 경사 단면 섬유는 인위적으로 높은 CSA 측정을 미칠 정도) 섬유 방향에 광범위하게 의존하는 섬유의 크기에 따라서 적합하지 측정을 예로들 수 있습니다. 섬유 단면적에 덜 의존 섬유 크기의 바람직한 측정 번째의 측정이다 최소의 Feret 지름 (MinFeret 직경)이며근육 세포 (12) 전자 곡경. 이 측정은 섬유 방향에 약간 의존 일반적으로 섬유 측정을위한 임상 금 표준이며, 조사는이 기술을 사용하는쪽으로 이동하는 것이 좋습니다. 이러한 측정들은 CSA 측정 (13)을 생성하는 동일한 소프트웨어를 사용하여 만들 수 및 수동으로 측정하는 간단하다 할 수 있습니다. 섬유 유형, 특정 근육과 특정 질환과 관련된 병리 소견의 컨텍스트에 따라 병리학 적 데이터를 평가에 대하여,이 단지 연구 계획 단계에서 고려되어야 덜 논쟁 거리이다. 섬유 유형은 면역 조직 염색 또는 ATP 아제를 사용하여 평가 될 수 있지만, 특정 근육과 동물 종은 이러한 유형의 섬유의 특정 혼합물 (따라서 서로 다른 기대치를 필요로하고 전략 테스트)이 있는지 체크하는 것이 유용하다. 근육 특정 병적 인 참여 또는 치료 효능발생하고, 전체 근육 중량 컨트롤에 비해 병리학 적 평가하는 근육을 결정하기 전에 질병의 불균일의 정도를 식별하는 데 사용될 수있다. 마지막으로, 잘 많은 근육 질환이 (예 : 네 말린 근육 병증의 네 말린 막대와 같은) 특정 병리학 적 이상 (14, 15)과 관련된 것으로 알려져있다, 그래서 이들의 이상이 섬유 형 또는 근육에서 발견되는 여부를 고려하는 것도 유용합니다 특정 분포 16,17 분석을 수행하는 단계를 포함한다. 우리가 근육의 평가를위한 기준의 유연성 세트를 제안하지 않지만 전반적으로, 우리는이 문제가 이전에 어떤 골격 근육 질환의 병리학 적 연구의 성과에 고려되어야한다고 믿는다.
공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 출판물은 Cure CMD, AFM(Association Contre Les Myopathies) 보조금(프로젝트 16297) 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health)(보조금 번호 K08 AR059750 및 L40 AR057721)을 통해 자금을 지원받습니다. 또한 이 원고를 수정하는 데 도움을 주신 Julie Tetzlaff 박사님께도 감사드립니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 조직 동결 | |||
| 액체 인출 장치를 사용한 액체 질소 듀어 | 맞춤형 바이오 제닉 시스템 | Lab-5 시리즈 | 다른 액체 질소 듀어를 대체할 수 있습니다. |
| 냉전도성 용기 | Fisher | 02-583A | |
| 액체 질소를 담을 수 있는 넓은 절연 용기 | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 열전대 온도계 | Thomas Scientific | 1228Y01 | 선택 사항이지만 이소펜탄이 동결되는 지점을 식별하는 데 매우 유용할 수 있습니다. |
| 단일 섬유 기능 테스트를 | |||
| Petri | 접시 Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard 코팅 | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| 해부 실체현미경 | Harvard Apparatus | 693101 | 다른 해부 현미경이 대체할 수 있습니다. |
| 세포 배양의 | |||
| 멸균 층류 후드 | Thermo Scientific | 51022485 | 다른 세포 배양 후드를 대체할 수 있습니다. |
| 티슈 동결 | |||
| 플라스틱 봉지/용기 | Nasco | B01009WA | |
| 열 안전 장갑 | Denville | G4162 | |
| 페이스 쉴드 | Fisher Scientific | S47640 | |
| 긴 펜치 | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| 마커 | 스테이플 | 125328 | |
| 세포 배양 | |||
| 멸균 50 ml 원추형 튜브 | Denville | C1060-P | |
| PES 필터 유닛, 500 ml, 0.22 µ m | Denville | F5227 | |
| 멸균 집게 | Fisher Scientific | 644320 | |
| 아이스팩 | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| 절연 스티로폼 상자 | Polar Tech | 207F | |
| 포장 테이프 | 스테이플 | 795570 | |
| 조직 동결 | |||
| 액체 질소 | Airgas | NI NF160LT350 | 저온 액체용으로 설계된 용기에 액체 질소를 보관하십시오. |
| 이소펜탄 (2-메틸부탄) | 시그마 | M32631-4L | 이소펜탄을 가연성 물질 캐비닛에 보관하십시오. |
| EM 고정제(하나 선택) | EM 고정 조직은 EM을 위해 즉시 처리되지 않는 경우 몇 시간 또는 며칠 후에 고정제에서 완충액으로 이동해야 하므로 고정제가 없는 완충액도 사용할 수 있어야 합니다. | ||
| 0.1M cacodylate buffer in 2.5% glutaraldehyde Electron | Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (0.1M 인산염 완충액 내 3% 글루타르알데히드 + 2% 파라포름알데히드) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| 기능 연구용 (원하는 경우) | |||
| (mmol/L 단위) | |||
| 40 BES | 시그마 | B9879 | |
| 10 EGTA | 시그마 | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | 시그마 | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | 시그마 | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-프로피오네이트 | 프로프리온산 (Sigma P1386)과 KOH (Fisher P250)를 혼합하여 용액을 만드십시오 1:1 | ||
| 15 크레아틴 인산염, pH 7.0 | 시그마 | P7936 | |
| 0.4 루펩틴 | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| 스키닝 솔루션, 함유 | |||
| 릴렉싱 솔루션 (위 참조) | |||
| 0.5 % Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 실리카 과립 | |||
| 평평한 조각 (1 x 1 인치) | 전자 현미경 과학 | 63305 | |
| 글리세롤 | 시그마 | G2025 | |
| 세포 배양 (원하는 경우) | |||
| 완전 성장 배지, 함유 (500 ml 용) | 500 ml 0.22 µ를 통해 용액을 여과하여 살균합니다. m PES 필터 장치. 4°C에 저장; C를 복용하고 1개월 이내에 사용하십시오. | ||
| 고혈당 Dulbecco 395ml 의 변형된 독수리' s 미디엄 (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 소 태아 혈청 100 ml (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 100X 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(PSG) 5mlSigma | G1146 | ||
| 보관 사양에 |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
